土霉素、金霉素和四环素的检测方法

1. 分析目标化合物
土霉素，金霉素，四环素
2. 仪器设备
带荧光检测器的高效液相色谱仪。
3．试剂
除下列试剂外，使用附录2所列试剂。
咪唑：特级
咪唑缓冲溶液：将68.08g咪唑、0.37g EDTA 和10.72g乙酸镁溶解在800mL水中，用乙酸调节pH7.2后，加水至1,000mL。
含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液：第1液：将21.0g柠檬酸溶解在水中至1,000mL。第2液：将71.6g磷酸氢二钠溶解在水中至1,000mL。在1.86g乙二胺四乙酸中加入307mL第1液和193mL第2液混合的溶液溶解。
苯乙烯二乙烯苯共聚物小柱 (265mg)：在内径8～9mm 聚乙烯管中填充265mg柱色谱用苯乙烯二乙烯苯共聚物或具有同等分离特性的物质。
4．标准品
盐酸土霉素：本品1.000mg 含有土霉素0.850mg以上效价，分解点为190℃～194℃。
盐酸金霉素：本品1.000mg含有盐酸金霉素0.900mg以上效价，分解点为210℃以上。
盐酸四环素：本品1.000mg 含有盐酸四环素0.900mg以上效力，分解点为214℃以上。
5．试验溶液的制备
a 提取方法
①肌肉、肝脏和肾脏
肌肉：尽可能除去脂肪层，搅碎混合均匀后，称取其5.00g。
肝脏和肾脏：搅碎混合均匀后，称取其5.00g。
加入30mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液，搅拌1分钟后，以每分钟3000转离心分离10分钟，水层移入100mL分液漏斗中。离心分离管的残留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液，用振荡器激烈振荡1分钟后，按上述同样条件离心分离，合并水层于上述分液漏斗中。加入20mL正己烷, 用振荡器激烈振荡5分钟后，以每分钟3000转离心分离10分钟，分取水层。
② 脂肪
脂肪：尽可能除去肌肉层，搅碎混合均匀后，称取其20.0g。
加入200mL正己烷，搅拌1分钟后，加入40mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液，再搅拌1分钟后，以每分钟3000转离心分离10分钟，分取水层。正己烷层中加入20mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液，用振荡器激烈振荡1分钟后，按上述同样条件离心分离，分取水层，合并于先分取的水层中。
③ 奶
称取5.00g样品，加入30mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液和20mL正己烷，用振荡器激烈振荡5分钟后，以每分钟3000转离心分离10分钟，分取水层。
④ 蛋
除去蛋壳，充分均匀后，称取其5.00g。加入30mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液，均匀后，加入100mL正己烷，搅拌1分钟后，以每分钟3000转离心分离10分钟，水层移入100mL分液漏斗中。离心管的残留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液，用振荡器激烈振荡1分钟后，按上述同样条件离心分离，合并水层于分液漏斗中。加入20mL正己烷, 用振荡器振荡5分钟后，以每分钟3000转离心分离10分钟，分取水层。
⑤ 鱼贝类
有壳贝类：除去壳，搅碎混合均匀后，称取其5.00g。
其它的鱼贝类：搅碎混合均匀后，称取其5.00g。
加入30mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液，搅拌1分钟后，以每分钟3000转离心分离10分钟，水层移入100mL分液漏斗中。离心管的残留物中加入20mL含有乙二胺四乙酸的柠檬酸缓冲溶液，用振荡器激烈振荡1分钟后，按上述同样条件离心分离，合并水层于分液漏斗中。加入20mL正己烷, 用振荡器激烈振荡5分钟后，以每分钟3000转离心分离10分钟，分取水层。
b 净化方法
在苯乙烯二乙烯苯共聚物小柱（265mg）中，顺次注入10mL甲醇、10mL水和5mL饱和EDTA溶液，弃去流出液。柱中注入a提取方法所得的溶液后，注入10mL水，弃去流出液。注入10mL甲醇，收集流出液于磨口减压浓缩器中，40℃以下除去甲醇。残留物中加入1.0mL 1.36％磷酸二氢钾溶液溶解，此为试验溶液。
6．操作方法
a 定性试验
按下列操作条件进行试验，试验结果必须与标准品的一致。
操作条件
柱填充剂：十八烷基甲硅烷基化硅胶(粒度5μm)。
柱：内径4.0～6.0mm，长150mm不锈钢管。
柱温： 40℃
检测器：激发波长380nm，发射波长520nm。
流动相：土霉素和四环素试验时，用咪唑缓冲溶液：甲醇(17：3)的混合溶液。调整流速使土霉素约5分钟流出。
金霉素试验时，用咪唑缓冲溶液：甲醇(3：1)的混合溶液。调整流速使金霉素约7分钟流出。
b 定量试验
根据与a 定性试验相同操作条件所得的试验结果，峰高法或峰面积法定量。
7．定量限
a 肌肉，肝脏，肾脏，奶，蛋和鱼贝类
土霉素：0.02 mg/kg
金霉素：0.03 mg/kg
四环素：0.02 mg/kg
b 脂肪
土霉素：0.005 mg/kg
8．注意事项
(1) 试验溶液的制备
① 离心分离温度保持在室温。
② 抽滤后滤液混浊时，滤液再次进行离心分离。
③ 在苯乙烯/二乙烯苯共聚物柱色谱中，注入试验溶液后，30mL水分数次加入效果较好地洗浄柱中残留的乙二胺四乙酸。
(2) 标准溶液的配制
①称取相当于10.0mg土霉素的标准品，溶解在甲醇中至10mL，作为土霉素的标准原液（土霉素1,000mg（效价）／L，1,000mg／L）。本标准原液保存在-20℃，1年内稳定。
②称取相当于10.0mg金霉素的标准品，溶解在甲醇中至10mL，作为金霉素的标准原液（金霉素1,076mg（效价）／L，1,000mg／L）。本标准原液保存在-20℃，1年内稳定。
③称取相当于10.0mg四环素的标准品，溶解在甲醇中至10mL，作为四环素的标准原液（四环素1,082mg（效力）／L，1,000mg／L）。本标准原液保存在-20℃，1年内稳定。
④用1.36%磷酸二氢钾溶液将土霉素，金霉素和四环素各标准原液递减稀释，作为制作标准曲线用的标准溶液。
(3) 其它
①同时进行很多样品试验的筛选试验法提高判断効率时，用「○土霉素，金霉素和四环素的筛选法（参照117 页）」判断为陽性的，不妨用本检测方法实施试验。
②使用本检测方法检出土霉素，金霉素和四环素时，最好用带质量检测器的高效液相色谱仪确证。
   
   

 

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