质粒载体可以克隆的DNA最大片段一般在10kb左右，但在构建一个基因文库时往往需要克隆更大的DNA片段以减少克隆的数量。为此，人们将噬菌体发展成为一种克隆载体。
λ噬菌体属于双链线性DNA分子。野生型λ噬菌体内含有太多的限制性酶切位点，需要经过改造后才能成为可应用的载体。Charon系列λ噬菌体有插入型和替换型两种，带有来自大肠杆菌的β半乳糖苷酶基因lacZ。M13噬菌体是单链环状DNA，改造后的M13mp8，加入了大肠杆菌的lac操纵子，常用于核酸测序。
λ噬菌体是线性双链DNA分子，其长度为48502bp，两端各有由12个碱基组成的5’端凸出的互补黏性末端，当λDNA进入宿主细胞后，互补黏性末端连接成为环状DNA分子，这种由黏性末端结合形成的序列，称为cos位点；λ噬菌体为温和噬菌体，可以整合到宿主细胞染色体DNA上，以溶原状态存在，随染色体的复制而复制；λ噬菌体能包装本身长度的 75%～105%，约38～54kb的DNA片段。
构建λ噬菌体载体时，需要抹去某种限制性内切酶在入DNA分子上的一些识别序列，只在非必需区保留1～2个识别序列。若只保留1个识别序列，则可供外源DNA插入；若保留2个识别序列，则2个识别序列之间的区域可被外源DNA片段置换也可以用合适的限制性内切酶切去部分非必需区，但是所构建的入DNA载体应不小于38kb；同时在λ噬菌体分子合适区域应插入可供筛选的标记基因。
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