培养基原材料的生物学检验方法及检验指标

录入时间:2024-1-17 14:01:32 来源：食品微生物实验室质量管理手册（第二版）

生物学指标检验是营养类原材料最主要和最关键的指标,直接关系培养基的质量好坏。原材料生产厂家和培养基生产厂家都应重点进行检测。主要检测的指标有可发酵糖试验、H2S试验﹑靛基质(吲哚)试验、V-Р试验﹑生长试验﹑色素试验﹑菌落总数检测和耐热芽孢杆菌总数等。

1．可发酵糖试验
称取样品2.0g、氯化钠0.5g、酚红0.002g、蒸馏水或去离子水100mL,配制成溶液，调节其pH值至7.2～7.4,分装于含有小倒管的试管中,每管6.0mL,115℃高压灭菌15min后，接种大肠埃希氏菌和鼠伤寒沙门氏菌18h~24h的新鲜培养物，35℃±2℃培养18h～24h,观察结果。阴性结果：培养基颜色为橙红色或红色,不产气。阳性结果：培养基颜色变成黄色,产气或不产气。

2．H2S试验

称取样品1.0g、氯化钠0.5g、蒸馏水或去离子水100mL，配制成溶液，调节其pH值至7.2～7.6,分装于试管中,每管6.0mL,121℃高压灭菌15min后,接种鼠伤寒沙门氏菌的18h～24h的新鲜培养物,将醋酸铅(PbAc)试纸插人试管中,试纸下端距离液面2cm～3cm,盖好试管盖30℃～35℃培养24h~48h,观察结果。阳性结果:醋酸铅试纸条变黑，且黑色域不得小于0.5cm。阴性结果:醋酸铅试纸条不变黑或黑色域小于0.5cm。

3．靛基质(吲哚)试验

称取样品2.0g、氯化钠0.5g,蒸馏水或去离子水100mL,配制成溶液，调节其pH值至7.2～7.6,分装于试管中,每管6.0mL,121℃高压灭菌15min高压灭菌后,分别接种大肠埃希氏菌、鼠伤寒沙门氏菌的18h～24h 的新鲜培养物,35℃±2℃培养18h～24h。观察结果时每管加入2～4滴靛基质试剂。10s内液面上出现玫瑰红色环者为阳性,出现黄色者为阴性。大肠埃希氏菌应为阳性,鼠伤寒沙门氏菌呈阴性。

4．V-P试验

称取样品0.7g、葡萄糖0.5g、氯化钠0.5g,加100mL的蒸馏水或去离子水配制成溶液,调节其pH值7.2～7.4,以每管6.0mL分装115℃高压灭菌15min后,分别接种产气肠杆菌,大肠埃希氏菌的18h~24h新鲜培养物,35℃±2℃培养18h～24h。观察结果时，除去试管帽,依次加入VP试剂甲、乙液，甲液6滴,乙液2滴,混合均匀,放置36℃培养箱孵育30min,溶液变红色为阳性,不变色为阴性。产气肠杆菌呈阳性反应,大肠埃希氏菌呈阴性反应。

5．色素试验

称取样品2.0g、氯化钠0.5、琼脂1.2g,加入100mL的蒸馏水或去离子水中,加热完全溶解,调节pH值7.2～7.4,121℃高压灭菌15min高压灭菌后,待温度降到50℃左右时倾注平板﹐充分凝固后﹐四区划线接种金黄色葡萄球菌和铜绿假单胞杆菌的新鲜培养物,35℃±2℃培养18h~24h,观察结果,应生长良好,金黄色葡萄球菌有黄色色素生成﹐铜绿假单胞菌有绿色色素生成。

6．生长试验

(1)质控菌株
大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌﹑铜绿假单胞菌﹑福氏志贺氏菌、乙型溶血性链球菌。
(2)液体培养基生长试验(九管法）
1)培养基配制:2.0g样品、0.5g氯化钠,加入到100ml的蒸馏水或去离子水中,加热完全溶解，调节 pH值至7.2～7.4,分装试管，每管9ml，121℃高压灭菌15min后,冷却备用。
2)操作方法:将质控菌株18h～24h新鲜培养物用无菌水制成108标准菌悬液(与标准比浊管比较),10倍梯度稀释至10^-7,依次接种10^-5,10^-6,10^-7菌悬液于液体培养基管中,每个浓度重复3管,35℃±2℃培养18h～24h。同时用合格品做对照品,样品应与对照品结果基本一样或优于对照品时，判为合格。
(3)固体培养基生长试验(平皿定量滴加法）
1)培养基配制:2.0g样品、0.5g氯化钠、1.2g琼脂，加入到100ml的蒸馏水或去离子水中,加热完全溶解,调节 pH值7.2～7.4,121℃高压灭菌15min后,倒平板,待充分凝固后并倒置于37℃培养箱1h~2h后，备用。

2)操作方法:制备好的固体培养基，用记号笔成90°交叉划线分成四份，依次滴加10mL，浓度为10⁴CFU/mL、10⁵CFU/ml、10⁶CFU/ml、10⁷CFU/ml的质控菌株菌液(见图4-5-1),轻轻摇动,待菌液吸干后倒置于35℃±2℃培养18h～24h。同时用合格品做对照品,样品应与对照品结果基本一样或优于对照品时，判为合格。

(4)生长试验结果评判
1)九管法和平皿定量滴加法都合格时，此原材料适合绝大部分培养基使用。
2)九管法合格，而平皿定量滴加法不合格时，此原材料适合于大部分液体培养基使用。
3)九管法不合格，而平皿定量滴加法合格时，此原材料适合于大部分含琼脂培养基使用。
4)两种都不合格时，此原材料为不合格，最好不要用于配制培养基。

7．菌落总是检测

称取25g样品溶解于225mL无菌蒸馏水或去离子水后，制成10倍系列稀释液，选取两三个适宜稀释度，吸取1mL样品液涂布于平板计数琼脂(PCA)平板上,36℃±1℃培养48h±2h计数结果,需做2个重复。

8．耐热芽孢杆菌检测

称取25g样品溶解于225mL无菌蒸馏水或去离子水后,制成10倍系列稀释液，选取两三个适宜稀释度，吸取lmL样品液涂布于葡萄糖胰蛋白豚琼脂平板上,55℃±1℃培养48h±2h计数结果﹐需做⒉个重复。

主要营养类原材料的生物学检验指标见表4-5-2。

原材料名称	可发酵糖试验	H₂S 试验	靛基质 (吲哚)试验	V-P 试验	色素试验	生长试验	菌落总数 /(CFU/g)	耐热芽孢杆菌总数/(CFU/g)
肉蛋白胨	-	+	+/-	+/-	+/+	合格	＜5000	0
大豆蛋白胨	-	+	+/-	+/-	+/+	合格	＜5000	0
酪蛋白胨	-	+	+/-	+/-	+/+	合格	＜5000	0
明胶蛋白胨	-	+	+/-	+/-	+/+	合格	＜5000	0
酵母浸出粉	-	//	//	//	//	合格	＜5000	＜10
牛肉浸出粉	-	//	//	//	+/+	合格	＜5000	＜10
注:“-”表示阴性反应，“＋”表示阳性反应,“//”表示不检测此项指标，靛基质试验中:大肠埃希氏菌与鼠伤寒沙门氏菌用“/”分开表示，V-P试验中:产气肠杆菌与大肠埃希氏菌用“/”分开表示，色素试验中:金黄色葡萄球菌与铜绿假单胞菌用“/”分开表示。

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