基因工程载体的设计

载体设计在基因工程中占有十分重要的地位，对基因转录、翻译和产物表达、基因工程菌培养和产物分离等都具有很重要的影响。在基因工程产物的研究开发中，质粒设计需要生物科学家和工程专家的紧密协作。

通过对DNA重组技术中的各种载体的分析，可以发现，作为DNA重组的载体，一般应具备如下条件：①能够进入宿主细胞；②可以在宿主细胞中存活并独立复制，即本身是一个复制子，或者能够整合到宿主细胞的染色体；③要有筛选标记，如抗生素抗性标记、营养缺陷型标记等，以便于筛选出重组细胞，同时在重组细胞培养时还能利用筛选标记以抑制不含载体细胞的生长，提高细胞培养和产物表达的效率；④对多种限制酶有单一或较少的酶切位点，最好是单一切点，使基因操作容易进行；⑤能容纳目的基因。

目的基因至少应包括：启动子、目的蛋白的基因序列及终止子。常见的用于大肠杆菌的启动子列于表11.4.3。用于霉菌的启动子有：Cbh1、glaA、gpd及alcA等。

理想的启动子应该是受到很好调节的强启动子，同时，宿主细胞的基底调节蛋白质产生水平应该是零。启动子对诱导剂的响应要迅速、诱导剂价格低、使用安全，诱导方法不但能够在试验室小试中应用，还应考虑在工业规模的可行性。例如温度诱导在小规模培养时较容易实现，但在大发酵罐中要改变温度会产生严重的滞后、对细胞产生热冲击响应及增加蛋白水解酶的活力，就不是十分合适。另外许多化学诱导剂价格昂贵，如果残留在产品中还会造成健康问题。某些启动子需要营养缺陷进行诱导，存在着怎样精确地控制诱导的问题。

与载体中启动子相对应的是目的基因转录的终止子（terminator）。如果采用强启动子，就必须有强终止子与之匹配。终止子的作用是：在目的基因被转录后当读到特定的密码子时会释放出RNA聚合酶以结束转录。如果终止子不够强，RNA聚合酶得不到及时释放，就会造成不需要基因的转录，而且会干扰控制质粒拷贝数的基因单元，严重时还会发生质粒复制失控和细胞死亡。原则上基因密码表中的终止密码都能用于终止子，典型的用于E.coli的终止子有：Rho factor；T1及T2系列的转录终止子等。

DNA重组使用的载体可以分为三大类：①克隆载体。是以繁殖DNA片段为目的的载体；②表达载体。用于目的基因的表达；③穿梭载体。穿梭载体是一类人工构建的具有两套复制起点和筛选标记、可以在两类不同细胞中存活和复制的质粒载体，它们能携带外源DNA序列在不同物种的细胞间，特别是在原核和真核细胞间往返穿梭，一般用于真核生物DNA片段在原核生物中增殖，然后再转入真核细胞宿主表达，如用于大肠杆菌和酵母细胞的穿梭质粒及大肠杆菌和哺乳动物细胞的穿梭质粒等。

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