目的基因与载体DNA的连接

  含有目的基因的DNA片段既不会自我复制也无法表达相应的产物，必须同能够自我复制的载体DNA分子（如质粒及病毒分子等）结合后才能在宿主细胞内随着质粒的复制而复制，并表达产物。

  核酸限制性内切酶和DNA连接酶对外源DNA片段同载体分子连接起了关键作用。目的基因与载体的连接可分为互补黏性末端、非互补的黏性末端和平末端的连接。本节将只讨论黏性末端DNA片段的连接。

  大多数核酸限制性内切酶切割DNA分子后都能形成具有1～4个单链核苷酸的黏性末端。若用同样的限制酶切割载体和外源DNA，或是用能够产生相同黏性末端的限制酶切割时，所形成的DNA末端就能够彼此退火，并被T连接酶共价地连接起来，形成重组DNA分子。当然，所选用的核酸酶对克隆载体分子最好只有一个识别位点，而且还应位于非必要区段内。

  根据是否用一种或两种不同的限制酶消化外源DNA和载体，黏性末端DNA片段的连接方法可分为插入式（单酶切）和取代式（双酶切）两种。

  采用BamHI切割只有一个酶切位点的环状质粒时，环被打开成为线性分子，两端都留下了由四个核苷酸组成的单链，这种末端称为黏性末端。用BamHI切割含目的基因的DNA时，所获得的目的基因将具有与质粒完全互补的两个黏性末端。这样，在T4连接酶的催化下，质粒与目的基因的互补末端就能形成共价键，重组质粒重新成为了环状质粒（见图11.5.1）。但这种方法得到的外源DNA片段插入到质粒中时，可能有两种彼此相反的取向，这将增加筛选的难度。

  根据限制性核酸内切酶的性质，用两种不同的限制酶同时消化一种特定的DNA分子，将形成两个黏性末端不同的DNA片段。载体分子和待克隆的DNA分子，都是用同一对限制酶（HindⅢ和BamHI）切割，然后混合起来，那么载体分子和外源DNA片段将按唯一的一种取向退火形成重组DNA分子。这就是所谓的定向克隆技术，可以使外源DNA片段按一定的方向插入到载体分子中。

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