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1范围

第一法（色谱）适用于强化食品调制乳粉、特殊膳食用食品（不包括乳蛋白部分水解配方、乳蛋白深度水解配方或氨基酸配方以及氨基酸代谢障碍配方的特殊医学用途婴儿配方食品）和特殊用途饮料中烟酸和烟酰胺的测定。

第二法（微生物）适用于各类食品包括以天然食品为基质的强化食品食品中烟酸（或烟酰胺）的测定。

针对使用范围进行了变更。

2原理

第一法液相色谱法原理描述变更

样品经酶解、沉淀蛋白质等前处理后（沉淀蛋白质，高淀粉样品经淀粉酶酶解），在弱酸性环境下超声波振荡提取，以C18色谱柱分离，用紫外检测器检测261 nm波长处检测，根据色谱峰的保留时间定性，外标法定量，计算试样中烟酸和烟酰胺含量。

紫外波长的数值实际操作中仍使用261nm。

3.1试剂

3.1.1盐酸（HCl）：优级纯。

3.1.2氢氧化钠（NaOH）：优级纯。

3.1.3甲醇（CH3OH）：色谱纯

3.1.4异丙醇（C3H8O）：色谱纯。

3.1.5庚皖磺酸钠（C7H15NaO3S）：色谱纯。

3.1.6淀粉酶：酶活力≥1.5 µ/mg。

10.1.3高氯酸（HClO4）：体积分数为60%，优级纯

旧版使用高氯酸配置流动相，新版更改为盐酸。

3.2试剂配制

3.2试剂配制

3.2.1盐酸溶液（5.0mol/L）：量取415mL盐酸，加水定容至1000mL。

3.2.2盐酸溶液（0.lmol/L）：吸取8.3mL盐酸，加水定容至1000mL。

3.2.3氢氧化钠溶液（5.0mol/L）：称取200g氢氧化钠，加水定容至1000mL。

3.2.4氢氧化钠溶液（0.1mol/L）：吸取20mL氢氧化钠溶液（5.0mol/L），加水定容至1000mL。

10.2.5流动相：甲醇70mL、异丙醇20mL、庚烷磺酸钠1g，用910mL水溶解并混匀后，用高氯酸调pH至2.1±0.1，经0.45µm膜过滤。

5.2液相色谱参考条件

液相色谱参考条件如下：

a）液相色谱柱：C18（粒径5µm，250mm×4.6mm）或等效柱。

b）流动相：甲醇70mL、异丙醇20mL、庚皖磺酸钠1g，用910mL水溶解并混匀后，用盐酸凋节pH至2.1±0.1。

c）柱温：25℃±0.5℃。

d）流速：1.0mL/min。

e）进样量：20µL。

f）紫外检测波长：261nm。

旧版使用高氯酸配置流动相，新版更改为盐酸。

3.3标准品

3.4标准溶液配制

3.3.1烟酸（C6H5NO2，CAS号：59-67-6）：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。

3.3.2烟酰胺（C6H6N2O，CAS号：98-92-0）：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。

3.4.1烟酸和烟酰胺标准储备溶液（1.000mg/mL）：将烟酸（或烟酰胺）标准品置入含五氧化二磷的干燥器中，干燥过夜。准确称取各0.1 g（精确到1mg），用0.1mol/L盐酸溶解，定容至100mL。2℃~8℃冷藏可保存1个月。

注：标准储备液配制完以后，需要进行浓度校正，校正方法见附录B。

3.4.2烟酸和烟酰胺标准混合中间液（100.0µg/mL）：准确吸取烟酸和烟酰胺标准储备液各10.0mL于100mL容量瓶中，加水定容至刻度，混匀。2℃~8℃冷藏可保存1个月。

3.4.3烟酸和烟酰胺标准混合工作液：分别准确吸取标准混合中间液1.0mL、2.0mL、5.0mL、10.0mL、20.0mL于100 mL容量脰中，加水定容至刻度，混匀，得到质量浓度分别为1.0µg/mL、2.0µg/mL、5.0µg/mL、10.0µg/mL、20.0µg/mL的标准混合工作液。临用现配。

标准品的纯度原99%，旧版无干燥器，冷藏温度4℃，新增冷藏保存时间。中间液旧版无保存条件，校正标准储备液删除。

4仪器和设备

4.1高效液相色谱仪：配紫外检测器或二极管阵列检测器。

4.2天平：感量分别为0.1mg和0.01g。

4.3恒温培养箱：30℃~80℃。

4.4超声设备。

4.5 pH计：精度为0.1。

4.6粉碎机。

11.6一次性微孔滤头：带0.45µm微孔滤膜。

5分析步骤

5.1样品前处理

5.1.1试样制备

样品预处理：取有代表性的样品至少200g，块状或颗粒状样品用粉碎机粉碎，粉末状、糊状或液体样品充分混匀，置于密闭的容器内。

5.1.2淀粉类和含淀粉的食品

5.1.2.1称取混合均匀固体试样约5.0g（精确到0.01g），置于150mL锥形瓶中，加入约25mL 45℃~50℃的水，加入约0.5g淀粉酶，摇匀后向锥形瓶中充氮，盖上塞，置于50℃~60℃的培养箱内酶解约30min，取出冷却至室温。

5.1.2.2称取混合均匀液体试样约20.0g（精确到0.01g），置于150mL锥形瓶中，加入约0.5g淀粉酶，摇匀后向锥形瓶中充氮，盖上塞，置于50℃~60℃的培养箱内酶解约30min，取出冷却至室温。

5.1.3不含淀粉的食品

5.1.3.1称取混合均匀固体试样约5.0g（精确到0.01g），置于150mL锥形瓶中，加入约25mL 45℃~50℃的水，置于超声设备中振荡约10min以上充分溶解，静置5min~10min，冷却至室温。

5.1.3.2称取混合均匀液体试样约20.0g（精确到0.01g），置于150mL锥形瓶中，置于超声设备中振荡约10min以上，充分溶解，静置5min~10min，冷却至室温。

样品预处理标明样品200g，并且将固体液体试样的步骤分开，实际方式步骤上无变更。

5.1.4试样提取

注1：必要时，试样测定液用水进行适当的稀释（f），使试样测定液中烟酸和烟酰胺质量浓度在1µg/mL~20µg/mL范围内。

注2：推荐充氮条件：压力0.055MPa~0.062MPa氮气充氮30s。

增加充氮条件。

6.1试样烟酸或烟酰胺含量计算

新增加的f为5.1.4中注1的稀释倍数。

6.2试样烟酸和烟酰胺总含量计算

维生素PP更改为烟酸烟酰胺，同种物质。

计算结果有效位数变更。

8.其他

固体样品：当称样量为5g时，烟酸检出限为30µg/l00g，定量限为l00µg/100g，烟酰胺检出限为40µg/l00g，定量限为120µg/l00g。

液体样品：当称样量为20g时，烟酸检出限为7.5µg/100g，定量限为25µg/100g，烟酰胺检出限为10µg/100g，定量限为30µg/100g。

当称样量为5g时，烟酸检出限为30µg/100g，定量限为100µg/100g，烟酰胺检出限为40µg/100g，定量限为120µg/100g。

增加了样品不同的检出限，对应5.1步骤固体液体不同样品处理。

9原理

烟酸和烟酰胺是植物乳植杆菌（LactiPLantibaciLLusPLantarum）生长所必需的营养素，在烟酸测定培养基中，植物乳植杆菌的生长与烟酸（或烟酰胺）的含量呈相关性，根据烟酸（或烟酰胺）含量与透光率（或吸光度）的标准曲线计算出试样中烟酸（或烟酰胺）含量。

菌名进行变更。

10试剂和材料

除非另有规定，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T6682规定的一级水或二级水。

增加可用一级水。

10.1菌株

植物乳植杆菌（LactipLantibaciLLuspLantarum）（原植物乳杆菌，LactobaciLLuspLantarum）ATCC8014或等效菌株。

10.3试剂

3.2.1盐酸（HCl）。

10.3.1无水乙醇（C2H5OH）。

10.3.2硫酸（H2SO4）95%~98%。3.2.4浓硫酸（H2SO4）。

10.3.3氢氧化钠（NaOH）。

10.3.4氯化钠（NaCl）。

标定了硫酸纯度要求。

10.5标准品

10.5.1烟酸（C6H5NO2，CAS号：59-67-6）：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。

10.5.2烟酰胺（C6H6N2O，CAS号：98-92-0）：纯度≥98%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准品。

烟酸（C6H5NO2）：纯度≥99.5%，或经国家认证并授予标准物质证书的标准物质。

纯度要求更改。

10.6标准溶液配制

10.6.1烟酸（或烟酰胺）标准储备液（50µg/mL）：将烟酸（或烟酰胺）标准品置于含五氧化二磷的干燥器中，干燥过夜。按纯度称取，使烟酸（或烟酰胺）含量为50.0mg（精确至0.00lg），用乙醇溶液（25%）

溶解移入l000mL容量瓶，定容至刻度。

原为称取50.0mg烟酸标准品，用乙醇溶液溶解至500mL容量瓶中，定容，新版使用1000mL的容量瓶。且没有干燥过夜的操作。

10.6.2烟酸（或烟酰胺）标准中间液（500ng/mL）：吸取1.0mL烟酸（或烟酰胺）标准储备液（50µg/mL）至100mL容量瓶，用乙醇溶液（25%）定容至刻度。

原为吸取1.0mL烟酸标准储备液置于100mL棕色容量瓶中，用乙醇稀释定容。

10.6.3烟酸（或烟酰胺）标准工作液：分两个质量浓度，高质量浓度溶液的质量浓度为10ng/mL,低质量浓度溶液的质量浓度为5ng/mL。从中间液中（500ng/mL）吸取2次，各2mL，分别移入l00mL和200mL容量瓶，用水定容至刻度。

注：配制标准溶液使用棕色容量瓶，配制后的标准溶液要用棕色试剂瓶2℃~8℃冷藏于冰箱内。标准储备液和中间液保存期6个月，标准使用液临用现配。

称量和容器变更，新版新增标准溶液储存时间和条件要求。

11仪器和设备

11.1分析天平：感量为0.1mg和0.01g。

11.2离心机。

11.3涡旋混合器。

11.4pH计：精度为0.01

11.5恒温培养箱：36℃±1℃。

11.6分光光度计：540nm~60nm。

11.7酶标仪：540nm~660nm。

11.8冰箱：2℃~8℃。

11.9无菌微孔板。

11.10定量滤纸：直径90mm。

11.11试管：18mm*180mm。

11.12容量瓶：容量100mL、200mL、250mL、500mL。

11.13单刻度移液管：1mL、5mL、10mL。

11.14刻度吸管：5mL（具0.1mL刻度）。

11.15玻璃漏斗：直径100mm。

11.16锥形瓶：容量250mL。

11.17烧杯：容量100mL。

11.18分液器：0mL~10mL。

11.19微量移液器：1000µL，200µL。

11.20无菌离心管：1.5mL。

11.21针头过滤器：孔径0.22µm。

注：清洗后的玻璃器皿和金属器具在250℃下干热1h~2h。

删除：均质设备、压力蒸汽消毒器、超净工作台、超声波振荡器。

12分析步骤

12.1测试菌悬液制备

12.1.1将植物乳植杆菌菌株活化后，用接种针穿刺接种到乳酸杆菌琼脂培养基上，36℃±1℃培养16h~24h，再转种2代~3代以增强活力。以斜面培养物方式置冰箱冷藏，可保存1个月。

12.1.2将24h内活化后的菌株转种至已灭菌的乳酸杆菌肉汤中，36℃±1℃培养16h~4h。以3000r/min~5000r/min离心5 min，弃去上清液，加入10mL生理盐水，用涡旋混合器振荡该悬液，再离心约5min，弃去上清液。如前操作清洗2次~3次后，再加10mL生理盐水，振荡混匀。吸取适量该菌悬液于10mL生理盐水中，混匀制成测试菌悬液。

12.1.3以生理盐水做空白，用分光光度计于550nm波长下测定测试菌悬液透光率（%T），调整上述菌液加入量，使测试菌悬液透光率在60%T~80%T。

原为取出后放入2℃~4℃冰箱中保存。每月至少传种一次，作为储备菌株保存。

新规定离心机的转速。

原使用721分光光度计。

12.2试样提取

块状、颗粒状试样需粉碎；乳粉、米粉等粉状试样需混匀；果蔬、肉、蛋、鱼、动物内脏等需制成食糜；半固体食品等试样需匀浆混匀；液体试样用前振摇混合。

12.2.1固态试样：准确称取（精确至0.001g）试样于锥形瓶中，其中新鲜果蔬试样2g~5g；谷类、豆类、坚果类、内脏、生肉、干制试样0.2g~1g；乳粉、米粉等试样2g~3g；一般营养素补充剂、复合营养强化剂0.1g~0.5g；其他食品0.2g~1g。

12.2.2液体饮料或流质、半流质试样：称取5g~10g（精确至0.001g）（或用单刻度移液管吸取适量体积）于锥形瓶中。特殊用途饮料称取样品后不需按12.2.3进行处理，称样后直接定容至100mL（V）后，按12.2.4进行稀释。

如果试样烟酸（或烟酰胺）含量过低，可适当提高称样量。

12.2.3加入试样质量（以克计）10倍的硫酸溶液B（以毫升计），将上述混合物放入压力蒸汽灭菌器，121℃下水解30min，取出迅速水浴冷却至室温。用氢氧化钠溶液A和氢氧化钠溶液B调节pH至4.5±0.2，移入250mL（V1）容量瓶中，用水定容至刻度。

用定量滤纸过滤，最初约10mL滤液应弃去，吸取5mL（V2）滤液于100mL烧杯中，加水约20mL，用氢氧化钠溶液B调节pH至6.8±0.2，移入100mL（V）容量瓶中加水定容至刻度。

12.2.4稀释：根据试样中烟酸（或烟酰胺）含量用水对提取液进行适当稀释，使稀释后试样提取液中烟或烟酰胺）质量浓度为5ng/mL~12ng/mL。

固态和液体试样重新划分称样方式。

原来用0.1mol/L氢氧化钠溶液调pH至6.0~6.5，再用0.1mol/L盐酸调pH至4.5±0.1，现在是用不同浓度的氢氧化钠AB调到4.5±0.2。

12.3.1试管培养法

12.3.1.1标准曲线系列管

按表l顺序加入水、标准曲线工作液和烟酸测定用培养基至培养试管中，表l中每一编号需制作3管。未接种空白试管（UN）、接种空白试管（IN）、标准系列管S1~S8中烟酸（或烟酰胺）质量浓度分别为0ng、0ng、5ng/mL、l0ng/mL、l5ng/mL、20ng/mL、25ng/mL、30ng/mL、40ng/mL、50ng/mL。

标准曲线的浓度范围变小，提高测量精密度。

12.3.1.3灭菌

将标准曲线系列管和试样系列管放入压力蒸汽灭菌器，121℃下灭菌5min（商品培养基按标签说明进行灭菌），取出后迅速用水浴冷却到室温。为了保证加热和冷却过程中温度均匀，灭菌试管不应距离灭菌器内壁过近，试管摆放不应过密，以免影响空气流通。

新版增加冷却到室温，强调了空气流通。

12.3.1.4接种

在无菌条件下，向上述每管中（标准曲线未接种空白管UN除外）各加入l滴（50µL~100µL）测试菌液，加盖，充分振荡混匀所有培养管。

明确滴加一滴的范围。

12.3.1.5培养

将试管放入恒温培养箱内，36℃土1℃下培养18h~24h。培养至浊度不变化。

12.3.1.6测定

新增空白对照要目视澄清。

进行两次空白测试。

新标准里试样超过标准曲线S1-S8范围的要舍去。

结果筛选要求更改。

12.3.2微孔板培养法

新增条目方法

12.3.2.1标准曲线系列离心管

将烟酸标准曲线工作液在无菌条件下过滤除菌至无菌离心管中，按表3制备3套标准曲线系列离心管。未接种空白孔（UN）、接种空白孔（IN）、S1~S8中烟酸（或烟酰胺）质量浓度与试管法相同。

新方法的标准曲线跟试管法的配制方法类似，区别于工作液增加量不同。

12.3.2.2试样系列离心管

将稀释后的试样提取液（12.2.4）无菌条件下过滤除菌，按表4制备3套试样系列离心管。

12.3.2.3接种和培养

烟酸测定培养基灭菌冷却后（或者尤菌条件下过滤除菌），每10 mL培养基中加入测试菌悬液（12.1.3）100µL~200µL，混匀，吸取150µL加入微孔板中。UN（未接种空白）使用未加入菌悬液的培养基。从标准曲线系列离心管和试样系列离心管吸取150µL加入微孔板中，覆膜，置于恒温培养箱中，36℃±1℃下培养18h~24h。

需留出空白对照UN。

12.3.2.4测定

培养结束后，对每个孔进行目测检查，未接种空白孔（UN）内培养液应是澄清的，否则测定无效。标准曲线孔和试样孔中培养液的吸光度应有梯度差别。将微孔板置于酶标仪内，540nm~550nm（或者610nm~630nm）选择稳定波长进行比色。

记录比色后的吸光度，数据处理同试管培养法12.3.1.6.2和12.3.1.6.3。计算全部编号试样孔的总平均值为p，按式（3）根据稀释倍数和称样量计算出试样中烟酸（或烟酰胺）的含量。

注：也可使用与本标准检测原理相同且经等效验证的烟酸和烟酰胺检测试剂盒。

数据处理与试管法相同。

13分析结果的表述

试样中烟酸（或烟酰胺）含量按式（3）计算。

计算结果保留3位有效数字

注1：对于特殊用途饮料等不经处理直接定容的样品，式中去除Vl和V2。

注2：如果用烟酸标准品配制标准溶液，测定结果则以烟酸计；如果用烟酰胺标准品配制标准溶液，测定结果以烟酰胺计。

注3：烟酰胺的结果乘以换算系数1.008，可以转化为烟酸的结果。

注4：如果样品中烟酸（或烟酰胺）含量较高，可适当进一步稀释；如果含量较低，可适当提高样品称样量或降低稀释倍数。

新增结果有效数字要求，烟酸烟酰胺换算系数。

14精密度

在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%。

普通食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的15%;

强化食品在重复性条件下获得的两次独立测定结果的绝对差值不得超过算术平均值的5%。

精密度合并

15其他

15.1需要提取的样品：当称样量为2g本标准定量限为1250µg/100g。

15.2特殊用途饮料等不经12.2.3步骤处理直接定容的样品：当称样量为10g时定量限为5µg/100g。

重新更改定量限，并新增特殊用途饮料的定量限。

培养基

版本

成分变更

配制方法变更

HB8636

乳酸杆菌琼脂培养基

新版

胨化乳15.0g

酵母浸膏5.0g

葡萄糖10.0g

番茄汁100mL

磷酸二氢钾2.0g

聚山梨糖单油酸酣1.0g

琼脂10.0g

蒸熘水1000mL

番茄汁的制备：将新鲜的西红柿洗净后称重切碎，加等量的蒸熘水在100℃水浴中加热，搅拌90min，然后用纱布过滤，校正pH为7.0±0.1，将浸出液分装后，121℃下高压灭菌15min。

将各成分加入蒸熘水中，加热溶解，搅拌的同时保持煮沸状态2min~3min，凋节pH至6.8±0.2（20℃~25℃），混合均匀后分装试管，每管10mL。121℃下高压灭菌15min。

旧版

光解胨15g

葡萄糖10g

磷酸氢二钾2g

聚山梨糖单油酸酯1g

番茄汁100mL

琼脂10g

蒸馏水1000mL

先将除琼脂以外的其他成分溶解于蒸馏水中，调节pH6.8±0.2（20℃~25℃），再加入琼脂，加热煮沸，使琼脂融化。

混合均匀后分装试管，每管10mL。121℃高压灭菌15min，备用。

HB8637

乳酸杆菌肉汤培养基

新版

胨化乳15.0g

酵母浸膏5.0g

葡萄糖10.0g

番茄汁100mL

磷酸二氢钾2.0g

聚山梨糖单油酸酯1.0g

蒸熘水1000mL

将各成分加入蒸熘水中，加热溶解，搅拌的同时保持煮沸状态2min~3min，凋节pH至6.8±0.2（20℃~25℃），混合均匀后分装试管，每管10mL。121℃下高压灭菌15min。

旧版

光解胨15g

葡萄糖10g

磷酸氢二钾2g

聚山梨糖单油酸酯1g

番茄汁100mL

蒸馏水1000mL

将上述成分溶解于水中，调节pH6.8±0.2（20℃~25℃），

分装10mL于试管中，121℃高压灭菌15min，备用。

HB7019-2

烟酸（或烟酰胺）测定用培养基

新版

去维生素水解酪蛋白12.0g

酪蛋白氨基酸12g

葡萄糖40.0g

乙酸钠20.0g

L-胱氨酸0.4g

DL-色氨酸0.2g

盐酸腺膘呤20.0mg

盐酸鸟膘呤20.0mg

尿嘧啶20.0mg

盐酸硫胺素200.0µg

泛酸钙200.0µg

盐酸吡哆醇400.0µg

核黄素400.0µg

对氨基苯甲酸200.0µg

p-氨基苯甲酸100µg

生物素0.8µg

磷酸氢二钾1.0g

磷酸二氢钾1.0g

硫酸镁0.4g

氯化钠20.0mg

硫酸亚铁20.0mg

硫酸猛20.0mg

蒸熘水1000mL

将上述成分溶解于水中，加热溶解，搅拌的同时保持煮沸状态2 min~3 min，凋节pH至6.8±0.2（20℃~25℃），备用。

旧版

将上述成分溶解于水中，调pH至6.7±0.2（20℃~25℃），备用。

序号

新标准（2023版）

旧标准（2016版）

名称

货号

名称

货号

1

乳酸杆菌琼脂培养基

HB8636

一致

一致

2

乳酸杆菌肉汤培养基

HB8637

一致

一致

3

烟酸（或烟酰胺）测定用培养基

HB7019-2

烟酸测定用培养基

HB7019-1