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利用抗生素抗性基因筛选



录入时间:2024-7-9 16:50:04 来源:青岛海博生物

这是一种最早发展而且目前仍广泛使用的方法。在DNA重组载体设计时已经在质粒中装配了抗生素抗性基因标记,如四环素抗性基因(Tetr)、氨苄青霉素抗性基因(Ampr)、卡那霉素抗性基因(Kanr)等。当编码有这些抗药性基因的质粒携带目的基因进入宿主细胞后,细胞就具有了相应的抗生素抗性,如果在筛选平板的培养基中加入有关抗生素,只有含质粒的细胞才能生长。这种方法只能证明细胞中确实已经有质粒存在,但无法保证质粒中已经携带了目的基因。为了防止误检,人们进一步发展了采用插入缺失的方法,同一质粒中往往有两种抗药性基因,在体外重组时故意将目的DNA插入到其中一个抗性基因中,使其失活,这样得到的宿主细胞便可在含另一抗生素的培养基中存活,但在两种抗生素都加入的平板上则不能生长。将这种菌株筛选出来,就能保证细胞中的重组质粒确实已经插入了目的基因。由于需要两次筛选,操作比较麻烦。

例如pBR322质粒上有两个抗生素抗性基因,抗氨苄青霉素基因(Ampr)上有单一的 PstI位点,抗四环素基因(Tetr)上有Sal I和BamH I位点。当外源DNA片段插入到 Sal I/BamH I位点时,使抗四环素基因失活,这时含有重组体的菌株从AmprTetr变为Ampr Tet8。这样,凡是在Ampr平板上生长而在AmprTetr平板上不能生长的菌落就可能是所要的重组体。

 

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