核酸杂交法筛选的简单介绍

利用碱基配对的原理进行分子杂交是核酸分析的重要手段，也是鉴定基因重组体的常用方法。核酸杂交法的关键是获得有放射性或非放射性但有其他类似放射性的探针，探针的 DNA或RNA序列是已知的。根据实验设计，先制备含目的DNA片段的探针，随后采用杂交方法进行鉴定。

核酸分子杂交的基本原理是：具有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA分子，当它们混合在一起时，其特定的同源区将会退火形成双链结构。利用放射性同位素³²P标记的DNA或RNA作探针进行核酸杂交，即可进行重组体的筛选与鉴定。

在DNA杂交实验中，目的DNA先变性，然后把单链的目的DNA在高温下结合到硝酸纤维素膜或尼龙膜上。单链DNA探针用放射性同位素或其他物质进行标记，与膜一起保温。如果DNA探针与样品中的某一核苷酸序列互补的话，那么通过碱基配对作用就可形成杂合分子，最后通过放射自显影或其他方式检测出来。通常，探针的长度在100bp至1kb之间，但有时用小于100bp或大于1kb的探针，也能得到较好的效果。杂交的反应条件非常重要，稳定的结合往往需要在最少50个碱基的片段中至少80%的碱基完全配对。

DNA探针既可用同位素标记，也可用生物素（biotin）等非同位素标记物连接到其中一种脱氧核糖核苷三磷酸中，然后掺入到新合成的DNA链。要检测这种标记需要一种中间化合物——链霉抗生物素蛋白（streptavidin）。该化合物能与生物素结合，同时细胞自身带有某种酶，可以催化形成有颜色的化合物，最后结果很容易易分辨出来。

核酸分子杂交的方法有：原位杂交、Southern 杂交及点杂交等。

将含重组体的菌落或噬菌斑由平板转移到滤膜上并释放出DNA，变性并固定在膜上，再同DNA探针杂交的方法称为原位杂交。Southern 杂交是一种典型的异位杂交，1975年由Southern设计创建并以他的名字命名。该方法将重组体 DNA 用限制酶切割，分离出目的 DNA后进行电泳分离，再将其原位转至薄膜上，固定后用探针杂交。

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