三种支原体固体平板计数法

一、平板计数法的介绍

  现中国药典对培养基灵敏度的检查方法采用的是变色单位试验法（CCU法），即是将肺炎支原体ATCC 15531、口腔支原体ATCC 23714分别接种至支原体肉汤、精氨酸支原体肉汤中，于36℃±1℃培养至培养基变色，盲传两代后，将培养物接种至待检培养基中，做10倍系列稀释，肺炎支原体稀释至10^-7~10^-9，接种在支原体肉汤培养基内；口腔支原体稀释至10^-3~10^-5，接种在精氨酸支原体肉汤培养基内。每个稀释度接种3支试管，置36℃±1℃培养7d~14d，观察培养基变色结果。

  美国药典已舍弃了变色单位试验法，现使用的是平板计数法（CFU法），即是向100mL液体培养基和至少9 mL固体培养基中接入不超过100CFU的支原体，接种的支原体至少包含一株葡萄糖发酵型菌株（肺炎支原体或等效菌株）以及一株精氨酸水解型菌株（口腔支原体），液体培养基于36℃±1℃密闭容器中培养，固体培养基于36℃±1℃、5%~10% CO₂、湿润环境中培养。

  对比CCU和CFU法，显然CFU法对支原体的培养要求更为苛刻。采用CFU法，可更直观的观察支原体的菌落形态，也可对支原体的菌数进行计算。

二、肺炎支原体、口腔支原体检验依据

  人肺炎支原体、猪肺炎支原体、口腔支原体液体培养的试验方法依据于2020年版《中华人民共和国药典》，以上支原体固体平板培养的试验方法依据于《美国药典》。以上支原体固体平板培养的方法以及染色方法可参考文章《人肺炎支原体、猪肺炎支原体、口腔支原体固体平板法及染色镜检》-点击查看，这里不再叙述。

  人肺炎支原体、猪肺炎支原体固体平板计数用培养基推荐如表1所示，不同点在于，人肺炎支原体培养应搭配马血清或牛血清使用，猪肺炎支原体培养应搭配猪血清使用。

表1 肺炎支原体固体平板计数法推荐用培养基

  口腔支原体固体平板计数用培养基如表2所示，口腔支原体应搭配马血清或牛血清使用。

表2 口腔支原体固体平板计数法推荐用培养基

三、试验方法

  本次肺炎支原体、口腔支原体固体平板计数法使用的培养基分别是BHI、精氨酸支原体肉汤。

  平板的配制方法参考文章《猪肺炎支原体在固体平板上的培养方法及染色镜检》，这里不再叙述。使用BHI疫苗专用培养基肉汤、精氨酸支原体肉汤作为稀释液，将肺炎支原体、口腔支原体原液梯度稀释至10-9。

  人肺炎支原体固体平板计数法：吸取人肺炎支原体原液10^-1~10^-5稀释液共六个浓度分别涂布至BHI琼脂平板，涂布量为100 μL，10^-1~10^-9稀释液与固体平板均放置于36℃±1℃培养箱中培养，培养7d~21d。这里应注意，有条件的，需将平板置于5%~10%二氧化碳培养箱中正置培养，同时保持湿润环境，没有条件的，需使用封口膜对平板缝隙处进行封膜处理。

  猪肺炎支原体固体平板计数法：吸取猪肺炎支原体原液10^-1~10^-5稀释液共六个浓度分别涂布至BHI琼脂平板，涂布量为40μL（特制平板涂布量少较佳），10^-1~10^-9稀释液与固体平板均放置于36℃±1℃培养箱中培养，培养7d~21d。这里同人肺炎支原体固体平板培养的注意事项，此外，猪肺炎支原体较人肺炎支原体对潮湿环境的要求更高。

  口腔支原体固体平板计数法：吸取口腔支原体原液10^-1~10^-5稀释液共六个浓度分别涂布至精氨酸支原体琼脂平板，涂布量为100μL，10^-1~10^-9稀释液与固体平板均放置于36℃±1℃培养箱中培养，培养7d~14d即可。口腔支原体较肺炎支原体易于培养。

四、人肺炎支原体计数结果

  如图1所示，培养至13d时，人肺炎支原体稀释液10^-1~10^-8稀释管变至黄色。

图1 人肺炎支原体稀释液培养至13d

  培养至7d时，人肺炎支原体高浓度涂布平板可见支原体菌落，持续培养至17d时，低浓度平板上可见支原体菌落，10^-1~10^-4涂布平板如图2所示。为更好的展示菌落形态，截取平皿表面局部的菌落，此外，低浓度涂布平板表面上的菌落不易拍照，需对光拍照。

10^-1                         10^-2

10^-3                         10^-4

        图2 人肺炎支原体在固体平板上涂布的结果

  由图2可知，10-4涂布平板表面单菌落清晰可见（肉眼观察较图片更为清晰），可进行精确计数，10^-4平板表面菌落均数为230个（应注意图片为平板表面局部图，并非展示了所有菌落），该菌数是由10^-4稀释液涂布100μL菌液得到的，由于稀释液体系为10mL，则可推算1mL原液菌数为2.3×10⁷CFU人肺炎支原体，则10^-8稀释液理论接入了约2CFU人肺炎支原体，10^-9稀释液未有菌接入，结合图1可知，添加约2CFU人肺炎支原体可使支原体肉汤培养至13d时有颜色变化。

  应注意的是，由于梯度稀释存在一定的误差，若振荡不均匀，可能导致10^-8稀释管未有菌接入，结果即是无论延长培养多少天，10^-8稀释管均不会发生变色；误差也可能导致10^-9接入了菌，结果即是延长培养一定天数后，10^-9稀释管也会发生颜色变化。

  为验证该菌落为人肺炎支原体，对该菌落进行染色，染色镜检图片如图3所示。

图3 人肺炎支原体染色镜检

五、猪肺炎支原体计数结果

如图4所示，培养至12d时，猪肺炎支原体稀释液10^-1~10^-9稀释管变至黄色。

图4 猪肺炎支原体稀释液培养至12d

  培养至7d时，猪肺炎支原体高浓度涂布平板可见支原体菌落，持续培养至14d时，低浓度平板上可见支原体菌落，10^-2~10^-5涂布平板如图5所示。为更好的展示菌落形态，截取平皿表面局部的菌落，此外，低浓度涂布平板表面上的菌落不易拍照，需对光拍照。

 10^-2                         10^-3

10^-4                         10^-5

        图5 猪肺炎支原体在固体平板上涂布的结果

  由图5可知，10^-5涂布平板表面单菌落清晰可见（肉眼观察较图片更为清晰），可进行精确计数，10^-5平板表面菌落均数为140个（应注意图片为平板表面局部图，并非展示了所有菌落），该菌数是由10^-5稀释液涂布40μL菌液得到的，由于稀释液体系为10mL，则可推算1mL原液菌数为3.5×10⁸CFU猪肺炎支原体，则10^-9稀释液理论接入了约4CFU猪肺炎支原体，结合图4可知，添加约4CFU猪肺炎支原体可使支原体肉汤培养至12d时有颜色变化。

  为验证该菌落为猪肺炎支原体，对该菌落进行染色，染色镜检图片如图6所示。

图6 猪肺炎支原体染色镜检

六、口腔支原体计数结果

  如图7所示，培养至8d时，口腔支原体稀释液10^-1~10^-7稀释管变至粉红，延长培养至12d时，10^-8稀释管也变至粉红。

图7 口腔支原体稀释液分别培养至8、12d

  培养至3d~5d，口腔支原体高浓度涂布平板可见支原体菌落，持续培养至8d时，低浓度平板上可见支原体菌落，10^-1~10^-4涂布平板如图8所示。为更好的展示菌落形态，截取平皿表面局部的菌落。

10^-1                         10^-2

10^-3                         10^-4

图8口腔支原体在固体平板上涂布的结果

  由图8可知，10^-4涂布平板表面单菌落清晰可见（肉眼观察较图片更为清晰），可进行精确计数，10^-4平板表面菌落均数为172个（应注意图片为平板表面局部图，并非展示了所有菌落），该菌数是由10^-4稀释液涂布100μL菌液得到的，由于稀释液体系为10mL，则可推算1mL原液菌数为1.72×10⁷CFU口腔支原体，则10^-8稀释液理论接入了约2CFU口腔支原体，添加17CFU口腔支原体可使精氨酸支原体肉汤培养至8d时有颜色变化，添加约2CFU口腔支原体可使精氨酸支原体肉汤培养至12d时有颜色变化。

  若培养相同时间，口腔支原体较肺炎支原体菌落要大许多，将10^-4稀释浓度涂布的平板延长培养至14d，口腔支原体的菌落状态如图9所示。

图9 延长培养至14d的平板表面的口腔支原体

  为验证该菌落为口腔支原体，对该菌落进行染色，染色镜检图片如图10所示。

图10 口腔支原体染色镜检

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