一、培养基pH调节试剂的介绍

  依据于《GB 4789.28 食品安全国家标准 食品微生物学检验 培养基和试剂的质量要求》、《中华人民共和国药典》等标准的质量控制，不同培养基具有不同的pH质控范围。对于调节培养基pH所使用的试剂，一般使用1mol/L氢氧化钠或1mol/L盐酸，除此之外，调高pH常用的试剂还有碳酸钠和碳酸氢钠。

  在大多数人的认知里，使用氢氧化钠溶液调培养基pH，灭菌后pH会下降，使用碳酸钠溶液调pH，灭菌后pH变化不明显，使用碳酸氢钠溶液调pH，灭菌后pH会上升。其中特别是氢氧化钠，培养基灭菌后pH下降的现象归因于氢氧化钠本身，而实际情况可能并非如此。

  为分析培养基灭菌后pH变化的具体原因，示例分析了TSA、SDA、mcpc培养基，为更直观的表示灭菌后pH的变化，对含酸碱指示剂的支原体肉汤进行了详细分析。

二、培养基灭菌前后pH变化的原因分析

  为还原试验人员最真实的培养基灭菌情况，试验不使用成品培养基，分别配制了TSA（参照药典）、SDA（参照药典）、mcpc培养基（去除纤维二糖），其中TSA分别使用不同胨类配制，标记为TSA-1~TSA-5。使用氢氧化钠调节pH后灭菌，灭菌前后pH如表1所示。

表1 多款培养基灭菌前后pH的比较

  由表1可知，使用氢氧化钠调节培养基pH，灭菌后pH不一定下降，甚至还有pH上升的培养基（TSA-1和TSA-4），由此可见，氢氧化钠不一定是导致培养基pH变化的原因，可能是其它成分引起的，例如pH下降最明显的SDA，该培养基含大量的葡萄糖，葡萄糖经121℃高压灭菌后，葡萄糖首先脱水形成5-羟甲基糠醛，5-羟甲基糠醛再分解为乙酰丙酸和乙酸，这一过程中有酸性物质生成，会导致溶液的pH降低，同时形成了一种有色物质而产生褐变。为进一步分析这一原因，对含有酸碱指示剂的支原体肉汤进行灭菌前后的pH分析。

  首先，分别使用氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠调节支原体肉汤的pH，灭菌前后pH的变化情况如表2所示。

表2 分别使用氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠调节支原体肉汤pH

  如表2所示，使用氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠调节pH的支原体肉汤灭菌后pH分别下降、变化不明显、上升。培养基的颜色变化如图1所示，无论使用何种试剂调节pH，灭菌后支原体肉汤的颜色均变深，这可能也是与葡萄糖的反应有关。

图1 葡萄糖褐变使培养基颜色加深

  为验证以上结论，对不调pH的支原体肉汤进行灭菌，对剔除葡萄糖的支原体肉汤分别使用氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠调pH后灭菌，灭菌前后pH的变化情况如表3所示。

表3 不含葡萄糖支原体肉汤灭菌前后pH变化情况

  由表3可知，对于剔除葡萄糖的支原体肉汤，使用氢氧化钠调节pH灭菌后pH保持不变，而含有葡萄糖不调pH的支原体肉汤灭菌后pH下降了0.46，这一数值与表2中支原体肉汤（使用氢氧化钠调pH）pH下降了0.49的数值基本一致。这说明氢氧化钠经高压灭菌后pH保持稳定，支原体肉汤pH下降是由葡萄糖引起来的。

  由表3还可知，碳酸钠、碳酸氢钠经高压灭菌后pH均上升，碳酸氢钠相比碳酸钠经高压灭菌水解程度更高，因此pH上升幅度更大。由于剔除了葡萄糖，培养基不会再受葡萄糖反应的影响，由此培养基不会产生褐变，如图2所示。

图2 剔除葡萄糖的支原体肉汤灭菌后不会变褐

  值得一提的是，无论使用氢氧化钠，还是碳酸钠、碳酸氢钠调节pH，支原体肉汤只要含有葡萄糖，均会产生一定的褐变现象，如图3所示，这有碍于阳性管与阴性管的对比度，影响试验结果的观察，更重要的是，葡萄糖作为肺炎支原体的主要营养，会极大的影响肺炎支原体的生长。

图3 支原体肉汤灭菌后是否含葡萄糖的颜色比较

三、降低培养基褐变的方法

  已知，支原体肉汤经不同操作人员灭菌后，培养基褐变程度不一，使用落地式灭菌锅相比手提式灭菌锅褐变程度要高，这是由于落地式灭菌锅一般降压更慢，由此灭菌时间相对更长。为验证这一规律，对支原体肉汤进行灭菌，灭菌结束且压力降至0时及时取出培养基为一组，不及时取出焖30分钟后再取出培养基为第二组。为排除其它因素的影响，首先对不含葡萄糖的支原体肉汤进行这一试验。

  不含葡萄糖的支原体肉汤，经氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠调节pH后灭菌，不同灭菌时间pH的变化如表4所示。

表4 不含葡萄糖支原体肉汤不同灭菌时间的pH变化

  由表4可知，支原体肉汤不含葡萄糖时，灭菌结束后，无论灭菌时间多少，pH无明显变化。说明不含葡萄糖情况下，灭菌时间对pH无影响，这一规律同时满足氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠调节pH的支原体肉汤。培养基的颜色变化如图4所示，不含葡萄糖的支原体肉汤未产生褐变现象。

图4 不含葡萄糖的支原体肉汤灭菌时间对培养基颜色无影响

（注：“焖锅”为培养基灭菌结束后不取出，使培养基继续停留在灭菌锅中）

  排除其它因素的干扰后，对含葡萄糖的支原体进行相同操作灭菌，灭菌前后的pH如表5所示。

表5 含葡萄糖支原体肉汤不同灭菌时间的pH变化

  由表5可知，含葡萄糖的支原体肉汤延长灭菌时间后，使用氢氧化钠、碳酸钠、碳酸氢钠调节pH的支原体肉汤pH的变化分别为pH下降程度提高、pH由上升转变为下降、pH上升程度降低，此外，不调pH的支原体肉汤pH下降的程度也提高了，说明延长灭菌时间会延长葡萄糖的反应时间，使支原体肉汤的pH持续下降。为降低支原体肉汤的褐变程度，灭菌结束后及时取出培养基是有效的方法。培养基的颜色变化图如图5所示。

图5 含葡萄糖的支原体肉汤灭菌时间对培养基颜色有影响

  由图5可知，使用碳酸氢钠调节pH的支原体肉汤褐变程度最高，这是由于葡萄糖在高pH时反应速率更快，说明灭菌时不适宜将pH调至过高。

四、总结

  1.pH调节试剂不是引起培养基灭菌前后pH变化的主要原因，葡萄糖经高压灭菌反应是引起培养基pH下降以及褐变的主要原因。

  2.为降低含糖培养基褐变的程度，灭菌结束后及时取出培养基是有效的方法，此外，由于葡萄糖在高pH情况下反应速率更快，因此灭菌时不适宜将pH调至过高。

五、注意事项

  培养基灭菌的注意事项可参考文章《培养基灭菌后颜色变深的原因探究及预防措施》点击查看。

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