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一、简要说明
GB 4789.40—2024于2024.2.8发布，于2024年8月8日实施。新标准与GB 4789.40—2016相比，主要变化如下：
修改了标准名称；
标准适用范围增加了婴幼儿辅助食品；
增加了PCR鉴定方法作为选做内容；
删除了挑取黄色菌落和生化鉴定中产黄色素和苦杏仁苷的项目；
修改了培养基和试剂pH调节方法；
修改预热、选择性增菌温度以及TSA平板的培养温度和时间；
修改了生化反应的培养温度及氨基酸培养基的制备。
二、对比详情
新旧版标准变更的内容详细列举如表1。
表1 新旧标准变更内容详细对比表格
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变更条目 |
变更内容 |
详情解释 |
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标题 |
食品安全国家标准食品微生物学检验克罗诺杆菌检验 |
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1 范围 |
本标准适用于婴幼儿配方食品、婴幼儿辅助食品、乳及乳制品及其原料中克罗诺杆菌的检验。 |
针对使用范围进行了变更，增加了婴幼儿辅助食品。 |
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第一法克罗诺杆菌定性检验 |
克罗诺杆菌定性检验 |
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2 设备和材料 |
除微生物实验室常规灭菌及培养设备外，其他设备和材料如下：
2.1 恒温培养箱： 2.2 冰箱：2℃~5℃，-20℃。 2.3 恒温水浴箱：41.5℃±1℃。 2.4 天平：感量0.1g、0.01g。
2.5 2.6 无菌吸管：1mL（具0.01mL刻度）、10mL（具0.1mL刻度）或微量移液器及吸头。 2.7 无菌容器：容量100mL、200mL、2000mL。 2.8 无菌培养皿：直径90mm。 2.9 pH计或pH比色管或精密pH试纸。 2.10 微生物生化鉴定系统。 |
更改了部分仪器设备的参数要求。 |
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2 设备和材料 |
2.11 PCR仪。 2.12 离心机：转速≥12000r/min。 2.13 凝胶成像系统或紫外检测仪。 2.14 琼脂糖水平电泳仪或毛细管电泳仪。 2.15 PCR反应管。 2.16 1.5mL离心管。 2.17 10μL接种环。 |
新增PCR相关设备和材料 |
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3 培养基和试剂 |
3.3 克罗诺杆菌显色培养基。 3.12 内转录间隔区（its）PCR引物见表1，基因扩增靶标参考序列见附录B。 3.13 5U/μL耐热DNA聚合酶。 3.14 2.5mmol/dNTPs：dATP、dTTP、dCTP、dGTP。 3.15 25mmol/L MgCl2。 3.16 10×PCR缓冲液：见A.10。 3.17 克罗诺杆菌质控菌株：具有菌种保藏资质单位提供的ATCC 29544或等效菌株。 3.18 大肠埃希氏菌质控菌株：具有菌种保藏资质单位提供的ATCC 25922或等效菌株。 3.19 DNA提取试剂：细菌基因组DNA提取试剂盒。 3.20商品化PCR反应预混液。 3.21标准（高熔点）琼脂糖：分析纯。 3.22核酸染色剂。 3.23分子质量标准：100 bp DNAladder。 3.24 50×TAE电泳缓冲液：见A.11。 3.25 6×DNA加样缓冲液：见A.12 |
显色培养基名称更改，新增PCR相关试剂，新增对质控菌株相关要求。 |
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4 检验程序 |
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PCR流程中如果全部阴性可以直接输出结果为检测结果阴性，如果阳性将进行生化鉴定步骤，经过PCR鉴定可以直接在阳性纯化的TSA平皿上选取菌落进行鉴定，未经过PCR步骤需要将可疑菌落依次进行生化鉴定直到出现阳性或全部为阴性。 |
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5 操作步骤5.1-5.2 |
5.1 前增菌和选择性增菌
取检样100g（mL）置于无菌容器中，加入900mL已预热至 5.2 分离
5.2.1 轻轻混匀mLST-Vm肉汤培养物，
5.2.2 可疑菌落按显色培养基要求进行判定，每个平板挑取至少5个可疑菌落（不足5个时挑取全部可疑菌落），分别划线接种于TSA平板， |
预热、选择性增菌的温度由44℃和25℃更改为41℃、41.5℃和36℃。 |
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5.3 PCR鉴定（选做） |
PCR试验环境条件和过程控制参照GB/T27403规定执行。 5.3.1 DNA模板制备 可采用热裂解法制备模板，从每个TSA平板上挑取2个~3个克罗诺杆菌可疑菌落至500μL灭菌去离子水中，充分混匀后100℃加热10min，冰浴冷却至室温，12000r/min离心10min，取上清液作为DNA模板用于PCR鉴定。若上清液不能及时分析则于-20℃保存备用(1周以内)。 注：也可用等效商品化的细菌基因组DNA提取试剂盒或全自动核酸提取仪按操作要求提取DNA模板。 5.3.2 PCR扩增 5.3.2.1 引物 PCR鉴定用引物信息见表1。
5.3.2 PCR扩增 5.3.2.2 PCR反应体系 PCR反应体系组成见表2。
注：也可用商品化PCR反应预混液按要求制备反应体系。 5.3.2 PCR扩增 5.3.2.3 反应条件：94℃预变性5min；94℃变性30s，61℃退火30s，72℃延伸30s，35个循环；72℃延伸5min，4℃下保存。 5.3.3 对照设置 每次PCR鉴定时使用克罗诺杆菌标准菌株DNA模板作为阳性对照，大肠埃希氏菌标准菌株DNA模板作为阴性对照，提取过程设置灭菌去离子水作为DNA提取空白对照，PCR反应需另设灭菌去离子水作为PCR反应体系空白对照。 |
新增选做内容PCR鉴定方法 |
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5.3 PCR鉴定（选做） |
5.3.4 电泳 用1×TAE电泳缓冲液制备含核酸染色剂的1.5%琼脂糖电泳凝胶(核酸染色剂按照说明书要求使用)。在电泳槽中加入电泳缓冲液，使液面没过胶面。将适量PCR扩增产物与6×加样缓冲液混合后点样，其中第1孔加入100bp DNAladder。电压的设置根据公式———电泳槽正负极的距离（cm）×5V/cm计算并设置，电泳时间为20min~30min。使用凝胶成像系统或紫外检测仪观察和记录结果。也可采用毛细管电泳仪等设备进行电泳。 5.3.5 PCR鉴定结果判定 质控系统：阴性对照和空白对照均未出现扩增条带，阳性对照出现预期大小（282bp，序列信息见附录B）的扩增条带，则检测系统正常。任一种对照出现非上述正常结果，应重做试验，同时排除干扰因素。 阳性结果：在质控系统正常的情况下，待测样品出现预期大小（282bp）的扩增条带，判定PCR结果为阳性。 阴性结果：在质控系统正常的情况下，待测样品未出现预期大小（282bp）的扩增条带，判定PCR结果为阴性。 |
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5.4确证试验 |
选做5.3时，自PCR结果阳性的TSA平板上挑取菌落进行生化鉴定，PCR结果阴性的TSA平板不再进行生化鉴定。 未选做5.3时，直接将5.2.2的可疑菌落接种TSA平板后进行生化鉴定。 可以首先鉴定克罗诺杆菌显色培养基平板上最具特征性的菌落接种的TSA平板上的菌落。 如果是阳性，则不需要测试其他TSA平板上的菌落。 如果是阴性，则选取其他TSA平板上的菌落进行鉴定，直到全部为阴性或发现阳性菌落为止。 自TSA平板上直接挑取黄色可疑菌落，进行生化鉴定。 为确保结果的准确性，对TSA平板上的菌落进行鉴定时，应使用新鲜的传代菌落。 克罗诺杆菌属的主要生化特征见表1。 克罗诺杆菌的主要生化特征见表3。
可选择生化鉴定试剂盒或全自动微生物生化鉴定系统。 上述鉴定也可选择商品化生化鉴定试剂盒或微生物生化鉴定系统进行。 |
在生化鉴定步骤中删除挑取黄色菌落的操作，并删除产黄色素及苦杏仁苷检测项目 |
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6 结果与报告 |
根据菌落特征、确证试验（生化鉴定）和/或PCR鉴定结果，报告100 g（mL）样品中检出或未检出克罗诺杆菌。 |
结果与报告部分加了根据PCR的鉴定结果进行报告是否检出克罗诺杆菌 |
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第二法克罗诺杆菌定量检验 |
克罗诺杆菌定量检验 |
名称更改 |
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7.1 样品的稀释 |
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将固体半固体和液体的取样稀释步骤合并，并且也更改了预热温度和增菌培养温度 |
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7.2 分离、鉴定 |
同5.2、5.3和5.4。 |
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8 结果与报告 |
综合菌落特征、确证试验（生化鉴定）或PCR鉴定结果，根据检出克罗诺杆菌的阳性管数，查MPN检索表，报告100g（mL）样品中克罗诺杆菌的MPN值（见附录C中表C.1）。 |
报告的要求增加了PCR的鉴定结果 |
新旧版标准培养基变更的内容详细列举见表2和表3。
表2 新旧版标准培养基变更内容详细对比表格（试验操作方法变更）
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培养基及货号 |
版本 |
成分 |
配制方法变更 |
试验操作方法变更 |
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L-赖氨酸脱羧酶培养基 |
新版 |
L-赖氨酸盐酸盐(L-lysine monohydrochloride) 5.0g 酵母浸膏3.0g 葡萄糖1.0g 溴甲酚紫0.015g 蒸馏水1000mL |
将各成分加热溶解，必要时调节pH。每管分装5mL，上面滴加一层液体石蜡，121℃高压15min。灭菌后的培养基25℃时的pH应为6.8±0.2。 |
挑取培养物接种于L-赖氨酸脱羧酶培养基液面下。36℃±1℃培养24h±2h，观察结果。L-赖氨酸脱羧酶试验阳性者，培养基呈紫色，阴性者为黄色，空白对照管为紫色。 |
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旧版 |
将各成分加热溶解，必要时调节pH至6.8±0.2。每管分装5mL，121℃高压15min。 |
挑取培养物接种于L-赖氨酸脱羧酶培养基，刚好在液体培养基的液面下。30℃±1℃培养24h±2h，观察结果。L-赖氨酸脱羧酶试验阳性者，培养基呈紫色，阴性者为黄色，空白对照管为紫色。 |
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L-鸟氨酸脱羧酶培养基 |
新版 |
L-鸟氨酸盐酸盐(L-ornithine monohydrochloride) 5.0g 酵母浸膏3.0g 葡萄糖1.0g 溴甲酚紫0.015g 蒸馏水1000mL |
将各成分加热溶解，必要时调节pH。每管分装5mL，上面滴加一层液体石蜡，121℃高压15min。灭菌后的培养基25℃时的pH应为6.8±0.2。 |
挑取培养物接种于L-鸟氨酸脱羧酶培养基液面下。36℃±1℃培养24h±2h，观察结果。L-鸟氨酸脱羧酶试验阳性者，培养基呈紫色，阴性者为黄色，空白对照管为紫色。 |
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旧版 |
将各成分加热溶解，必要时调节pH至6.8±0.2。每管分装5mL。121℃高压15min。 |
挑取培养物接种于L-鸟氨酸脱羧酶培养基，刚好在液体培养基的液面下。30℃±1℃培养24h±2h，观察结果。L-鸟氨酸脱羧酶试验阳性者，培养基呈紫色，阴性者为黄色。 |
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L-精氨酸双水解酶培养基 |
新版 |
L-精氨酸盐酸盐(L-arginine monohydrochloride) 5.0g 酵母浸膏3.0g 葡萄糖1.0g 溴甲酚紫0.015g 蒸馏水1000mL |
将各成分加热溶解，必要时调节pH。每管分装5mL，上面滴加一层液体石蜡，121℃高压15min。灭菌后的培养基25℃时的pH应为6.8±0.2。 |
挑取培养物接种于L-精氨酸脱羧酶培养基液面下。36℃±1℃培养24h±2h，观察结果。L-精氨酸脱羧酶试验阳性者，培养基呈紫色，阴性者为黄色，空白对照管为紫色。 |
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旧版 |
将各成分加热溶解，必要时调节pH至6.8±0.2。每管分装5mL。121℃高压15min。 |
挑取培养物接种于L-精氨酸脱羧酶培养基，刚好在液体培养基的液面下。30℃±1℃培养24h±2h，观察结果。L-精氨酸脱羧酶试验阳性者，培养基呈紫色，阴性者为黄色。 |
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新版 |
柠檬酸钠2.0g 氯化钠5.0g 磷酸氢二钾1.0g 磷酸二氢铵1.0g 硫酸镁0.2g 溴麝香草酚蓝0.08g 琼脂8.0g~18.0g 蒸馏水1000mL |
将各成分加热溶解（必要时调节pH）后分装到试管中，每管10mL，121℃高压15min，冷却后制成斜面。灭菌后的培养基25℃时的pH应为6.8±0.2。 |
挑取培养物接种于9.2中制备的培养基整个斜面，36℃±1℃培养24h±2h，观察结果。阳性者培养基变为蓝色，阴性者为绿色，空白对照管为绿色。 |
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旧版 |
将各成分加热溶解，必要时调节pH至6.8±0.2。每管分装10mL，121℃高压15min，制成斜面。 |
挑取培养物接种于整个培养基斜面，36℃±1℃培养24h±2h，观察结果。阳性者培养基变为蓝色。 |
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微小变化 |
N，N，N'，N'-四甲基对苯二胺盐酸盐1.0g 蒸馏水100mL |
少量新鲜配制，于冰箱内避光保存，在7d之内使用。 |
用玻璃棒或一次性接种针挑取单个特征性菌落，涂布在用氧化酶试剂湿润的滤纸平板上。如果滤纸在10s中之内未变为紫红色、紫色或深蓝色，则为氧化酶试验阴性，否则即为氧化酶试验阳性。 |
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糖类发酵培养基 基础培养基 |
新版 |
酪蛋白(酶消化) 10.0g 氯化钠5.0g 酚红0.02g 蒸馏水1000mL |
将各成分加热溶解，必要时调节pH。每管分装5mL。121℃高压15min。灭菌后的培养基25℃时的pH应为6.8±0.2。 |
见完全培养基变更 |
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旧版 |
将各成分加热溶解，必要时调节pH至6.8±0.2。每管分装5mL。121℃高压15min。 |
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新版 |
糖8.0g 蒸馏水100mL |
分别称取D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖等各8.0g，分别溶于100mL蒸馏水中，过滤除菌后，各制成80mg/mL的糖类溶液。 |
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糖类溶液（D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、 |
旧版 |
分别称取D-山梨醇、L-鼠李糖、D-蔗糖、D-蜜二糖、苦杏仁甙等糖类成分各8 g，溶于100mL蒸馏水中，过滤除菌，制成80mg/mL的糖类溶液。 |
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完全培养基 |
新版 |
基础培养基875mL 糖类溶液125mL |
无菌操作，将8.2.2中制备的每种糖类溶液各自加到基础培养基中，混匀后，分别制成每一种糖的完全培养基，再分装到无菌试管中，每管10mL。 |
挑取培养物接种于8.3.2中制备的各种糖类发酵培养基的液面下。36℃±1℃培养24h±2h，观察结果。糖类发酵试验阳性者，培养基呈黄色，阴性者为红色，空白对照管为红色。 |
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旧版 |
无菌操作，将每种糖类溶液加入基础培养基，混匀；分装到无菌试管中，每管10mL。 |
挑取培养物接种于各种糖类发酵培养基，刚好在液体培养基的液面下。30℃±1℃培养24h±2h，观察结果。糖类发酵试验阳性者，培养基呈黄色，阴性者为红色。 |
表3 新旧版标准培养基变更内容详细对比表格（无试验操作方法变更）
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培养基 |
版本 |
成分 |
制法 |
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缓冲蛋白胨水（buffered peptone water，BPW） HB4080（9mL HBPT031、含900mL BPW HBJ002-1、90mL BPW HBJ002-3） 缓冲蛋白胨水(BPW) |
新版 |
蛋白胨10.0g 氯化钠5.0g 磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O) 9.0g 磷酸二氢钾1.5g 蒸馏水1000mL |
加热搅拌至溶解，必要时调节pH，121℃高压灭菌15min。灭菌后的培养基25℃时的pH应为7.2±0.2。 |
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旧版 |
加热搅拌至溶解，调节pH至7.2±0.2，121℃高压灭菌15min。 |
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改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨（mLST）肉汤 |
新版 |
氯化钠34.0g 胰蛋白胨20.0g 乳糖5.0g 磷酸二氢钾2.75g 磷酸氢二钾2.75g 十二烷基硫酸钠0.1g 蒸馏水1000mL |
加热搅拌至溶解，必要时调节pH。分装至无菌试管中，每管10mL，121℃高压灭菌15min。灭菌后培养基25℃时的pH应为6.8±0.2。 |
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旧版 |
加热搅拌至溶解，调节pH至6.8±0.2。分装每管10mL，121℃高压灭菌15min。 |
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万古霉素溶液 HB0102-2a |
未更改 |
万古霉素10.0mg 蒸馏水10.0mL |
10.0mg万古霉素溶解于10.0mL蒸馏水中，过滤除菌。万古霉素溶液可以在0℃~5℃保存15d。 |
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改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（modified lauryl sulfate tryptose broth-vancomycin mediu，mLST-Vm） HB0102-2改良月桂基硫酸盐胰蛋白胨肉汤-万古霉素（mLST-Vm） |
微小更改 |
- |
每10mL mLST加入万古霉素溶液0.1mL，混合液中万古霉素的终浓度为10μg/mL。 注：mLST-Vm需在24h之内使用。 |
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胰蛋白胨大豆琼脂（trypticase soy agar，TSA） HB0177 |
新版 |
胰蛋白胨15.0g 植物蛋白胨5.0g 氯化钠5.0g 琼脂15.0g 蒸馏水1000mL |
加热搅拌至溶解，必要时调节pH，121℃高压15min，灭菌后的培养基25℃时的pH应为7.3±0.2。 |
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胰蛋白胨大豆琼脂（TSA） |
旧版 |
加热搅拌至溶解，煮沸1min，调节pH7.3±0.2，121℃高压15min。 |
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10×PCR缓冲液 |
新版 |
1mol/L Tris-HCl（pH8.5）840mL 氯化钾（KCl）37.25g 灭菌去离子水160mL |
将氯化钾置于少许1mol/L Tris-HCl（pH8.5）中，充分溶解后用1mol/L Tris-HCl（pH8.5）定容至1000mL，121℃高压灭菌15min，分装后-20℃保存。 |
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50×TAE电泳缓冲液 |
新版 |
Tris 242.0g EDTA-2Na(Na2EDTA·2H2O) 37.2g 冰乙酸(CH3COOH) 57.1mL 灭菌去离子水942.9mL |
将Tris和EDTA-2Na同时溶于800mL灭菌去离子水，充分搅拌均匀；加入冰乙酸，充分溶解后，用1mol/L NaOH调pH至8.3，并用去离子水定容至1000mL后，室温保存。使用时用去离子水稀释50倍即为1×TAE电泳缓冲液。 |
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6×DNA加样缓冲液 |
新版 |
溴酚0.5g 二甲苯氰FF 0.5g 0.5mol/L EDTA（pH8.0） 0.06mL 甘油360mL 灭菌去离子水640mL |
0.5mol/L EDTA（pH8.0）溶于500mL灭菌去离子水中，加入溴酚蓝和二甲苯氰FF溶解，与甘油混合，并用灭菌去离子水定容至1000mL，分装后4℃保存。 |
三、对比解读
（1）标准适用范围：标准名称更改，适用范围进行更改，增加了婴幼儿辅助食品。
（2）预热、选择性增菌的温度由44℃和25℃更改为41℃、41.5℃和36℃，显色培养基的名称更改。
（3）新增选做检测方法PCR法，并且PCR流程中如果全部阴性可以直接输出结果为检测结果阴性，如果为阳性将进行生化鉴定步骤，经过PCR鉴定可以直接在阳性纯化的TSA平皿上选取菌落进行鉴定，未经过PCR步骤需要将可疑菌落依次进行生化鉴定直到出现阳性或全部为阴性。
（4）部分仪器设备增加参数要求，新增PCR相关仪器设备与耗材试剂。
（5）在生化鉴定步骤中删除挑取黄色菌落的操作，并删除产黄色素及苦杏仁苷检测项目。
（6）新版将定量检验步骤中，样品的处理进行变更，将固体半固体和液体的取样稀释步骤合并，并且也更改了预热温度和增菌培养温度。其他分离鉴定步骤与定性检验相同
（7）结果与报告部分增加了根据PCR的鉴定结果进行报告是否检出克罗诺杆菌。
四、涉及产品
新版本中主要对培养基的配制方式和使用试验操作进行变动，配制方式中增加了液体石蜡覆盖和对pH的调节要求，试验操作中的培养温度进行变更等。详细信息前文以提及。涉及的培养基产品信息见表4，名称与货号在新旧标准中一致。
表4 新标准中涉及的培养基及编号
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序号 |
名称 |
货号 |
序号 |
名称 |
货号 |
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1 |
9 |
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2 |
10 |
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3 |
11 |
||||
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4 |
12 |
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5 |
（推荐氧化酶试纸） |
（HB2100） |
13 |
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6 |
14 |
||||
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7 |
15 |
||||
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8 |
16 |
注：本文属海博生物原创，未经允许不得转载。
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