培养基高压蒸汽灭菌失败常见原因分析

一、高压蒸汽灭菌简介

  高压蒸汽灭菌是实验室常用的灭菌手段之一，常用于培养基、各种容器及敞开式器皿等物品的灭菌。大多数培养基采用的灭菌条件是121℃灭菌15min，准确来说，是培养基达到至少121℃，维持至少15min，可以达到较为理想的灭菌效果，灭菌温度越高，灭菌时间越长，灭菌失败的概率就越小，但同时要考虑培养基的性能问题，因此在对灭菌程序验证时，需同时兼顾灭菌效果与培养基性能两方面进行确定。

二、影响灭菌效果的因素

  对于绝大多数微生物包括芽孢体在内，在121℃灭菌8分钟条件下存活的概率不超过百万分之一，我们平常使用的121℃灭菌15分钟也是一种过度灭菌的方式了，因为实际情况比较复杂，影响灭菌条件的因素较多，即使如此，仍然会遇到灭菌失败的情况出现。

  （1）热穿透：前面已经说过，121℃灭菌15min严格来说应该是培养达到这个温度所持续的时间，而不是灭菌锅达到这个温度维持的时间，但市场上的灭菌锅基本上都是以灭菌锅的腔体温度达到121℃维持15min计算的，这样就存在一个问题，灭菌锅腔体温度到了121℃，但是培养基的温度没有达到121℃，或者培养基的温度迟缓到了121℃，但只维持了5分钟或10分钟，造成灭菌失败，也就是热穿透不够。锅内冷空气未排净、锅内摆放过满、灭菌体积过大、灭菌容器不透气等因素都会显著降低热穿透效果。

  （2）腔体内温度分布：灭菌锅本身由于质量问题的原因，国内可能存在温度不均一的问题，或者温度不达标的现象。灭菌锅在使用前，通常需要进行空载、半载、满载对内部各点位温度进行检定，以确认灭菌锅是否能达到良好的灭菌效果。

  （3）培养基的体积和初始温度：许多人习惯于将培养基直接加水溶解就拿去灭菌了，其实这是不对的，市场上售卖的大多数需要高压蒸汽灭菌的培养基的配制方法上都会写“加热溶解”或“加热煮沸”等信息，除了能让培养基快速溶解分布均匀以外，还可以使培养基初始温度提高，在灭菌锅里面可以更容易达到相应的灭菌温度。特别是配制体积比较大时，培养基升温更慢，更容易造成灭菌失败。

  （4）微生物负载：毫无疑问，灭菌前的培养基中微生物含量越少，耐热芽孢菌越少，越容易灭菌成功。很多时候你灭菌没有失败，并不是你的灭菌过程没有问题，而是培养基中耐热的微生物负载太低了。事实上如果培养基真正能达到121℃维持15min，培养基中耐热微生物数量即使再高也没有用。我们经常使用的生物灭菌指示，含有百万个数量级别耐热能力最强之一的嗜热脂肪芽孢杆菌的芽孢体，在121℃灭菌15min都能轻易被全部杀死，更何况是培养基中有限的菌。而在培养基灭菌过程中热穿透不够的情况下，耐热菌负载的高低就很容易影响灭菌效果。

三、减少高压蒸汽灭菌失败的措施

  以上分析可以得出，造成灭菌失败的原因，主要是各种细节导致热穿透不足，造成灭菌失败。

  （1）灭菌的验证：对灭菌锅的温度分布、灭菌效果做初步验证，确认设备本身没有问题；

  （2）冷空气的排除：现在使用的灭菌锅大多数为自动排气的，一般不需要手动排气。对于一些老式的灭菌锅，需要手动排净锅内的冷空气，再关闭放气阀升温。

  （3）灭菌锅的负载：避免灭菌锅内的物品摆放过满或摆放过于密集，留有一定的空间和间距更容易灭菌成功。

  （4）容器的透气性：高压蒸汽灭菌锅通常需要容器内的空气与灭菌锅内气体联通，但如果容器自身处于密闭状态，与灭菌锅内空气不流通，热量更难穿透，特别是体积大的情况下更容易灭菌失败，还有可能造成爆瓶现象，可以尝试使用水浴灭菌锅。

  （5）培养基的配制和体积：灭菌前对培养基进行加热煮沸溶解，对于大体积容器可分装至小瓶，一般的实验室灭菌锅建议灭菌培养基体积控制在500mL以下，最高不超过1L，更有利于培养基灭菌过程的快速升温。

注：本文属海博生物原创，未经允许不得转载。

上一篇：培养基过滤除菌失败原因分析及改进措施

下一篇：没有了！