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药品卫生检验方法


录入时间:2006-6-27 8:22:38 来源:其它

   
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          第一章  药品卫生检验通则
    一、供试品取样及注意事项
    1.供试品取样应有一定数量,以使检验结果具有代表性。因此,正常的供试品,一般每批应随机抽取两瓶或两盒以上的包装单位。检验时,每次最少应分取两瓶(盒)以上的样品共10克或10毫升,中药蜜丸至少应分取4丸以上共10克;贵重或微量包装的供试品,取样量可酌减

    2.凡异常的供试品,则选取有疑问的样品进行检验。
    肉眼能看出发霉生虫变质、活螨的样品,应判为不合格,无需再作抽样检验。
    3.检查活螨的样品抽样量,见活螨的检验法。
    4.供试品在检验前,应严格保持包装的原有状态,不得启开,防止再污染。并放在阴凉干燥处,防止微生物再繁殖,以免影响检验结果。凡已将原包装启开,则无代表性,应另行取样。
    5.供试品在检验过程中,从开封至全部检验操作结束,须防止微生物再污染和扩散。凡直接与样品接触的用具,均应事先灭菌并保持无菌;全部操作须在无菌室内进行,或在相应的条件下,按无菌操作规定进行。
    6.供试品稀释后,须在1—2小时内操作完毕,防止微生物繁殖或死亡。
    7.供试品稀释成供试液后,应在均匀状态下取样。凡因抑菌或不溶于水的剂型,其供试品应作特殊处理后进行检验。
    8.从供试品检出大肠杆菌或其它致病菌的报告发出起,该菌种保存一个月备查。如有疑问,可送药检部门或上一级药检单位复核。
    二、供试品制备
    1.凡固体样品,应称取10克,加在100毫升稀释剂(生理盐水或磷酸盐缓冲液)中,经充分研磨或振摇制成供试液。液体样品,则可量取10毫升加在90毫升稀释剂中,混匀后成供试液。
    2.凡含有防腐剂或抑菌成份且影响检验的供试品,可经离心沉淀集菌法及其他适宜的方法处理后,检验大肠杆菌和其他致病菌。集菌处理法如下:
    取供试液10毫升,以无菌手续放在灭菌的尖底刻度离心管中,经每分钟3500转以上离心沉淀30分钟,用灭菌毛细吸管吸取上清液弃掉,并留下管底的2毫升残余液,将其全部洗净加在培养基中,进行增菌检验。含有不溶性药渣的样品稀释液,可均匀吸取10毫升放在离心管中
,先经每分钟500转左右离心沉淀5分钟,取其上清液放在另一灭菌尖底刻度离心管中,再经每分钟约3500转以上离心沉淀30分钟,轻轻吸取上清液弃掉,取其管底的2毫升残余液全部洗净加在培养基中,增菌检验即得。
    3.非水溶性的软膏、乳膏、油膏剂等,可称取样品5克,放在乳钵或烧杯中,加8毫升灭菌的吐温—80充分研磨匀后,加入经140°干热灭菌半小时的西黄蓍胶2.5克研磨匀。再加少量45°的稀释剂充分研磨,使呈均匀乳剂。随后边加入稀释剂边研磨,使成100毫升乳剂
,移至三角瓶中,即为1∶20供试液。
    或称取供试品2.5克,分别量取液体石蜡10毫升,吐温—80.10毫升,稀释剂30毫升。先将供试品置乳钵中,边研磨边滴加液体石蜡;然后再边研磨边滴加吐温—80,研磨均匀后;再边加入稀释剂边研磨,开始每次约1毫升,待起团块时,加入稀释剂3毫升,稍停一分钟
,再轻轻研磨至乳化,将稀释剂加完为止,即得1∶20供试液。
    4.滤膜法:取规定量的供试品,按1毫升加入灭菌生理盐水50毫升左右,摇匀,用灭菌吸管或注射器注入薄膜过滤器内,减压抽干后,用灭菌生理盐水或其他适宜的溶剂冲洗薄膜3次,每次50毫升。取出薄膜,剪成几条,加至10毫升灭菌稀释剂中,充分摇动,使成供试液。可
供细菌、酵母菌和霉菌计数用。或将剪成几条的上述薄膜加至有关的增菌培养基中培养,可供检查绿脓杆菌或金黄色葡萄球菌用。
    三、阳性菌株对照试验
    1.为便于研究观察成药制剂中,某些含有防腐剂和抑菌成份的干扰作用,以及测试常规检验方法和培养基、试剂等的灵敏度时,可将定量的已知阳性对照菌加在供试品稀释液中,按检验供试品的操作方法进行阳性菌的对照试验。阳性对照菌应生长。
    2.常用的阳性对照菌株,卫生部检定所编号:大肠杆菌44102、沙门氏菌50094、绿脓杆菌10104、金黄色葡萄球菌26003和破伤风杆菌64067等。
    3.对照试验加入的已知活菌量,每批供试品应控制在50—100个范围之内,需氧菌常用的计数方法,如金黄色葡萄球菌可用37℃培养18—20小时
                                  -6
新鲜肉汤培养物,十倍递增稀释至10    ,取其0.1
                                -7
毫升按琼脂平板表面涂抹法或取10    稀释液1毫升按浇碟法进行活菌数测定。按每毫升菌液内所含的活菌量,取适量加在供试品里,对照检验即得。破伤风杆菌的阳性对照以作毒力试验为主(具体操作见破伤风杆菌检验项下。)
    
    
    4.作阳性菌株对照试验时,应注意安全,严格防止对照菌污染供试品和环境。为此,加入阳性菌的操作可在另外无菌室或其他适宜的地方进行。
  
          第二章  药品卫生检验法
    一、细菌总数测定法
    细菌总数的测定,是考察供试品每克或每毫升内所污染的活菌数量。测定结果便于判明供试品被细菌污染的程度,以及生产单位所用的药品原料、工具设备和工艺流程、操作者的卫生状况,是对供试品进行卫生学总评价的综合依据。
    1.供试品的测定:
    固体供试品,以无菌操作称取若干克,按下列方法之一进行稀释:
    (1)将已称取供试品置入灭菌乳钵中加入适量稀释剂,充分研磨,然后移至于灭菌三角瓶中,共加入稀释剂100毫升,使成1∶10均匀供试液。
    (2)将已称取的供试品连同100毫升的稀释剂加入灭菌三角瓶或其他相应容器内,进行振荡,使成1∶10的均匀供试液。
    液体供试品,可量取10毫升加入90毫升稀释剂,混匀即得。
    用1毫升灭菌吸管,吸取1∶10供试液1毫升,沿管壁注入装有9毫升灭菌的稀释剂试管内,混匀即为1∶100稀释液。
    另取1毫升灭菌吸管,按上项操作顺序作10倍递增稀释。如此每递增稀释一次,应换用1支1
                                  -3
毫升灭菌吸管并充分混匀,稀释至10    或适当倍数备检。
    
    
    另用1毫升灭菌吸管1支,按高倍稀释至低倍稀释的顺序分别吸取各稀释度的液体1毫升,注入直径9厘米的平皿内,或在作上述10倍递增稀释时,应稀释妥一稀释度,即可取1毫升稀释液注入平皿内。一般可根据对供试品污染情况的估计,从供试液起选择2—3个适宜稀释度进行
测定,每个稀释度各用2—3个平皿。
    稀释液注入平皿后,应及时将熔化并冷至45—50℃的肉汤琼脂培养基倾注平皿内,各约15毫升,随即转动平皿使充分混合均匀。待琼脂凝固后,翻转平板,置37℃培养箱内培养至24小时和48小时,并分别计算平板内生长的的菌落。一般以48小时的菌落数为准。
    为减少片状菌落的干扰,也可采用0.001%TTC琼脂,在无菌室开盖倒置或换灭菌的干燥陶瓦盖等方法使平板表面干燥后,再进行培养。
    2.菌落计数方法:
    先用肉眼观察,点数菌落数(霉菌不包括在内),然后持5—10倍放大镜检查有无遗漏。各平板菌落计数后,求出同一稀释度各平板生长的平均菌落数。如平板中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时,该平板不宜计数。
    3、细菌菌数报告:
    一般的报告方法是选取同一稀释度平均菌落数在30—300之间的平板,作为菌落总数测定的范围。如每个稀释度使用两个平板,应采用两个平板的菌落平均数。其中一个平板有较大片状菌落生长时,或两平板菌落数相差一倍以上,此稀释度不宜采用。如每个稀释度使用三个平板,
应采用三个平板菌落数的平均数,其中有两个平板菌落数较接近,另一个平板相差在一倍以上,或有片状菌落生长时,则应采用前者平均数为该稀释度的菌落数,按下列规则乘其稀释倍数报告之。
    稀释度的选择:
    (1)若只有一个稀释度,平均菌落数在30—300个之间时,乘以稀释倍数报告之(见表1例1)。
    (2)若两个稀释度,其平均菌落数均在30—300个之间,则应求出两者总菌数之比,凡比值小于或等于2应报告其平均数,若大于2则报告其中较小的数字。(见表1例2、3)。
    (3)若所有稀释度的平均菌落数均多于300个,则应按稀释度最高的平均菌落数,乘以稀释倍数报告之(见表1例4)。
    (4)若所有稀释度的平均菌落数均少于30个,则应按稀释倍数最低的平均菌落数,乘以稀释倍数报告之(见表1例5)。
    (5)若所有稀释度的平均菌落数均不在30—300之间,其中一个稀释度大于300,而相邻的另一稀释度小于30时,则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表1例6)。
    (6)若所有稀释度均无菌生长,报告数为<10个/克或毫升。
    菌数的报告,菌数在100以内时,按实有数报告之,大于100时,采用左端前二位数字,在前两位数字之后的数值,应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数,可用10的指数来表示(见表1)。
    如供试品经检验,细菌数不合格,需复验时,应重新取样,依法复试两次,细菌数仍有一次不合格时,则该供试品细菌数应判为不合格。
      表1  细菌计数结果及报告方法
------------------------------------------------
\  平均菌|        供试品稀释倍数      |两  数|    菌落    |
  \ 落数 |--------------|稀    |    总数    |  细菌总数报告方式
    \    |    -1|    -2|    -3|释  之|  (个/    |  (个/克或毫升)
例    \  |10    |10    |10    |度    |    克或    |
    次  \|        |        |        |菌  比|    亳升)  |
-----|----|----|----|---|------|----------------
          |        |        |        |      |            |            |              4
    1    |1365|  164|  20  |  —  |  16400|  16000|或1.6×10
-----|----|----|----|---|------|------|---------
          |        |        |        |      |            |            |              4
    2    |2760|  295|  46  |1.6|  37750|  38000|或3.8×10
-----|----|----|----|---|------|------|---------
          |        |        |        |      |            |            |              4
    3    |2890|  271|  60  |2.2|  27100|  27000|或2.7×10
-----|----|----|----|---|------|------|---------
          |        |        |        |      |            |            |              5
    4    |不可计  |4650|  513|  —  |513000|510000|或5.1×10
-----|----|----|----|---|------|------|---------
          |        |        |        |      |            |            |              2
    5    |  27  |  11  |  5    |  —  |  270    |  270    |或2.7×10
-----|----|----|----|---|------|------|---------
          |        |        |        |      |            |            |              4
    6    |不可计  |  305|  12  |  —  |  30500|  31000|或3.1×10
------------------------------------------------
    二、霉菌总数测定法
    霉菌总数(包括酵母菌)的测定,是考察供试品每克或每毫升内所污染活的酵母菌、霉菌数量,借以判明供试品的酵母菌、霉菌污染程度及其一般卫生状况。
    1.供试品的测定:
    供试液与稀释按细菌总数测定项下规定的方法进行。取供试液、1∶100和1∶1000的稀释液各1毫升分别注入平皿内,每个稀释度各用2—3个平皿,加入稀释液后将熔化并冷至45—50°的虎红琼脂培养基约15毫升倾入平皿内,充分摇匀。凝固后,翻转平板置25—2
8°培养72小时,计算平板内生长的霉菌菌落数。若有根霉或毛霉蔓延生长,为避免影响其它霉菌的计数时,应及时将此平板取出计数。
    2.酵母菌霉菌菌数报告:
    酵母菌、霉菌计数,应选取带有菌丝体的菌落和酵母菌菌落进行点数。先点清每个平板上生长的菌落数,再求出每一稀释度的平均菌落数。判定结果时,应选取平板上菌落数既清楚可数,平均又在5—50个范围以内的菌落数,乘以稀释倍数后,做为供试品的霉菌总数报告之。若有两
个稀释度的菌落数皆在5—50个以内或三个稀释度皆不在此范围之内时,应参照细菌总数测定的规则报告之。
    一般眼科制剂的细菌、霉菌总数测定按上述方法进行并报告之。如抗生素或有抑菌作用的制剂,采用适宜的方法处理后,按常规方法进行。
    如供试品经检验,霉菌总数不合格,需复检时,应重新取样,依法复试两次。霉菌数仍有一次不合格时,供试品应判为酵母菌、霉菌数不合格。
    三、大肠杆菌检验法
    大肠杆菌来源于人和温血动物的粪便。凡由供试品中检出大肠杆菌时,表明该药品已被粪便污染,患者服用后,有被粪便中可能存在的其它肠道致病菌和寄生虫卵等病源体感染的危险。因此,大肠杆菌被列为重要的卫生指标菌,是非规定灭菌口服药品的常规必检项目之一。
    大肠杆菌检验程序。
      表2  肠杆菌科各菌属的生化特性鉴别表
-------------------------------------------------------
            |    |    |爱  |    |亚  |枸  |克  |      肠  杆  菌  属    |    沙  雷  氏  菌  属  |
    菌属    |艾  |志  |德  |沙  |利  |橼  |雷  |------------|------------|
            |希  |贺  |华  |门  |桑  |酸  |伯  |    |    |  哈夫尼亚  |      |    |    液化  |
------|氏  |氏  |氏  |氏  |那  |杆  |氏  |阴沟|产气|------|粘  质|红色|-----|
  生化特性  |菌  |菌  |菌  |菌  |菌  |菌  |菌  |    |    |37℃|22-   |      |    |37℃|22- |
            |属  |属  |属  |属  |属  |属  |属  |    |    |    |25℃  |      |    |    |25℃|
------|--|--|--|--|--|--|--|--|--|--|---|---|--|--|--|
            |    |    |    |    |    |    |    |    |    |    |      |      |    |    |    |
靛基质      |+   |-/+ |+   |-   |-   |-   |-/+ |-   |-   |-   |-     |-     |-   |-   |-   |
            |    |    |    |    |    |    |    |    |    |    |      |      |    |    |    |
甲基红      |+   |+   |+   |+   |+   |+   |-   |-   |-   |+/- |-     |-/+   |-/+ |+/- |-/+ |
            |    |    |    |    |    |    |    |    |    |    |      |      |    |    |    |
V-P反应  |-   |-   |-   |-   |-   |-   |+   |+   |+   |+/- |+     |+     |+   |-/+ |+/- |
            |    |    |    |    |    |    |    |    |    |    |      |      |    |    |    |
西蒙氏枸橼  |-   |-   |-   |d   |+   |+   |+   |+   |+   |(+) |d     |+     |+   |+   |+   |
酸盐        |    |    |    |    |    |    |    |    |    |/-  |      |      |    |    |    |
------|--|--|--|--|--|--|--|--|--|--|---|---|--|--|--|
硫化氢(三糖|-   |-   |+   |+   |+   |+/- |-   |-   |-   |-   |-     |-     |-   |-   |-   |
铁)        |    |    |    |    |    |    |    |    |    |    |      |      |    |    |    |
            |    |    |    |    |    | w  |    |    |    |    |      | w    |-,  |    |    |
尿素酶      |-   |-   |-   |-   |-   |d   |+   |+/- |-   |-   |-     |d     |+)w |d   |    |
            |    |    |    |    |    |    |    |    |    |    |      |      |    |    |    |
氰化钾      |-   |-   |-   |-   |-   |+   |+   |+   |+   |+   |+     |+     |-/+ |+   |    |
            |    |    |    |    |    |    |    |    |    |    |      |      |    |    |    |
动力        |+/- |-   |+   |+   |+   |+   |-   |+   |+   |+   |+     |+     |+   |+   |+   |
            |    |    |    |    |    |    |    |    |    |    |      |      |    |    |    |
明胶(22℃)|-   |-   |-   |-   |(+) |-   |-   |(+) |-/  |    |-     |+/    |+   |    |+   |
            |    |    |    |    |    |    |    |/-  |(+) |    |      |(+)   |    |    |    |
-------------------------------------------------------
-------------------------------------------------------
赖氨酸脱羧  |d   |-   |+   |+   |+   |-   |+   |-   |+   |+   |+     |+     |+/  |+/- |+   |
酶          |    |    |    |    |    |    |    |    |    |    |      |      |(+) |    |    |
            |    |    |    |    |    |    |    |    |    |    |      |      |    |    |    |
精氨酸双水  |d   |-/  |-   |(+) |+/  |d   |-   |+   |-   |-   |-     |-     |-   |-   |-   |
解酶        |    |(+) |    |/+  |(+) |    |    |    |    |    |      |      |    |    |    |
            |    |    |    |    |    |    |    |    |    |    |      |      |    |    |    |
鸟氨酸脱羧  |d   |d   |+   |+   |+   |d   |-   |+   |+   |+   |+     |+     |-   |+   |+   |
酶          |    |    |    |    |    |    |    |    |    |    |      |      |    |    |    |
            |    |    |    |    |    |    |    |    |    |    |      |      |    |    |    |
苯丙氨酸脱  |-   |-   |-   |-   |-   |-   |-   |-   |-   |-   |-     |-     |-   |-   |    |
氨酶        |    |    |    |    |    |    |    |    |    |    |      |      |    |    |    |
            |    |    |    |    |    |    |    |    |    |    |      |      |    |    |    |
丙二酸钠    |-   |-   |-   |-   |+   |d   |+   |+/- |+/- |+/- |d     |-     |+/- |-   |    |
-------------------------------------------------------
-------------------------------------------------------
葡萄糖产气  |+   |-   |+   |+   |+   |+   |+   |+   |+   |+   |+     |+°/- |-/+ |+   |    |
            |    |    |    |    |    |    |    |    |    |    |      |      |    |    |    |
乳糖        |+   |-   |-   |-   |d   |(+) |+   |+   |+   |-/  |-     |-     |+   |d   |(+) |
            |    |    |    |    |    |/+  |    |    |    |(+) |      |      |    |    |    |
            |    |    |    |    |    |    |    |    |    |    |      |      |    |    |    |
蔗糖        |d   |-   |-   |-   |-   |d   |+   |+   |+   |d   |-/(+) |+     |+   |+   |    |
            |    |    |    |    |    |    |    |    |    |    |      |      |    |    |    |
甘露醇      |+   |+/- |-   |+   |+   |+   |+   |+   |+   |+   |+     |+     |+   |+   |+   |
------|--|--|--|--|--|--|--|--|--|--|---|---|--|--|--|
卫矛醇      |d   |d   |-   |d   |-   |d   |-/+ |-/+ |-   |-   |-     |-     |-   |-   |    |
            |    |    |    |    |    |    |    |    |    |    |      |      |    |    |    |
水杨甙      |d   |-   |-   |-   |-   |d   |+   |+/  |+   |d   |d     |+     |+   |+   |    |
            |    |    |    |    |    |    |    |(+) |    |    |      |      |    |    |    |
            |    |    |    |    |    |    |    |    |    |    |      |      |    |    |    |
侧金盏花醇  |-   |-   |-   |-   |-   |-   |+/- |-/+ |+   |-   |-     |d     |+   |d   |    |
            |    |    |    |    |    |    |    |    |    |    |      |      |    |    |    |
肌醇        |-   |-   |-   |d   |-   |-   |+   |d   |+   |-   |-     |d     |d   |+   |+   |
------|--|--|--|--|--|--|--|--|--|--|---|---|--|--|--|
山梨醇      |+   |d   |-   |+   |+   |+   |+   |+   |+   |-   |-     |+     |-   |+   |    |
            |    |    |    |    |    |    |    |    |    |    |      |      |    |    |    |
阿拉伯糖    |+   |d   |-   |+/  |+   |+   |+   |+   |+   |+   |+     |-     |+   |+   |+   |
            |    |    |    |(+) |    |    |    |    |    |    |      |      |    |    |    |
            |    |    |    |    |    |    |    |    |    |    |      |      |    |    |    |
棉子糖      |d   |d   |-   |-   |-   |d   |+   |+   |+   |-   |-     |-     |+   |d   |+   |
            |    |    |    |    |    |    |    |    |    |    |      |      |    |    |    |
鼠李糖      |d   |d   |-   |+   |+   |+   |+   |+   |+   |+   |+     |-     |-   |-   |-   |
------------------------------------------------------
------------------------------------
            |  果胶杆菌属|      形  杆  菌  属        |普罗菲登斯菌属
    菌属    |------|--------------|-------
------|    |      |      |    |      |      |    |
  生化特性  |37℃|22-   |      |    |      |      |    |
            |    |25℃  |普  通|奇异|摩根氏|雷极氏|产碱|司徒氏
------|--|---|---|--|---|---|--|----
            |    |      |      |    |      |      |    |
靛基质      |-/+ |-/+   |+     |-   |+     |+     |+   |+
            |    |      |      |    |      |      |    |
甲基红      |-/+ |+/-   |+     |+   |+     |+     |+   |+
            |    |      |      |    |      |      |    |
V-P反应  |-/+ |-/+   |-     |-/+ |-     |-     |-   |-
            |    |      |      |    |      |      |    |
西蒙氏枸橼  |d   |+/(+) |d     |+/  |-     |+     |+   |+
酸盐        |    |      |      |(+) |      |      |    |
------|--|---|---|--|---|---|--|----
硫化氢(三糖|-   |-     |+     |+   |-     |-     |-   |-
铁)        |    |      |      |    |      |      |    |
            |    | w    |      |    |      |      |    |
尿素酶      |d   |d     |+     |+/  |+     |+     |-   |-
            |    |      |      |(+) |      |      |    |
            |    |      |      |    |      |      |    |
氯化钾      |+/- |+/-   |+     |+   |+     |+     |+   |+
            |    |      |      |    |      |      |    |
动力        |+/- |+/-   |+     |+   |+/-   |+     |+   |+/-
            |    |      |      |    |      |      |    |
明胶(22℃)|    |+/(+) |+     |+   |-     |-     |-   |-
            |    |      |      |    |      |      |    |
------|--|---|---|--|---|---|--|----
赖氨酸脱羧  |-   |-     |-     |-   |-     |-     |-   |-
酶          |    |      |      |    |      |      |    |
            |    |      |      |    |      |      |    |
精氨酸双水  |-   |-/(+) |-     |-   |-     |-     |-   |-
解酶        |    |      |      |    |      |      |    |
            |    |      |      |    |      |      |    |
鸟氨酸脱羧  |-   |-     |-     |+   |+     |-     |-   |-
酶          |    |      |      |    |      |      |    |
            |    |      |      |    |      |      |    |
苯丙氨酸脱  |-   |-     |+     |+   |+     |+     |+   |+
氨酶        |    |      |      |    |      |      |    |
            |    |      |      |    |      |      |    |
丙二酸钠    |-/+ |-/+   |-     |-   |-     |-     |-   |-
------------------------------------
------------------------------------
葡萄糖产气  |-/+ |d     |+°/- |+   |d     |-/+   |d   |-
            |    |      |      |    |      |      |    |
乳糖        |d   |+/(+) |-     |-   |-     |-     |-   |-
            |    |      |      |    |      |      |    |
蔗糖        |+/- |+     |+     |d   |-     |d     |d   |(+)
            |    |      |      |    |      |      |    |/+
            |    |      |      |    |      |      |    |
甘露醇      |+/- |+     |-     |-   |-     |+/-   |-   |d
------|--|---|---|--|---|---|--|----
卫矛醇      |-   |-     |-     |-   |-     |-     |-   |-
            |    |      |      |    |      |      |    |
水杨甙      |d   |+     |d     |d   |-     |d     |-   |-
            |    |      |      |    |      |      |    |
侧金盏花醇  |-   |-     |-     |-   |-     |d     |+   |-
            |    |      |      |    |      |      |    |
肌醇        |d   |-     |-     |-   |-     |+     |-   |+
------|--|---|---|--|---|---|--|----
山梨醇      |-   |-     |-     |-   |-     |d     |-   |d
            |    |      |      |    |      |      |    |
阿拉伯糖    |d   |+     |-     |-   |-     |-     |-   |-
            |    |      |      |    |      |      |    |
棉子糖      |d   |+/(+) |-     |-   |-     |-     |-   |-
            |    |      |      |    |      |      |    |
鼠李糖      |d   |d     |-     |-   |-     |+/-   |-   |-
------------------------------------
注:+90%以上阳性;-90%以上阴性;(+)迟缓阳性;d有不同生化型;“微弱阳性;+°微产气;+/(+)多数阳性,少
    数迟缓阳性;(+)/+多数迟缓阳性,少数阳性;+/-多数阳性,少数阴性;-/+多数阴性,少数阳性;-/(+)多数阴
    性,少数迟缓阳性;(+)/-多数迟缓阳性,少数阴性;+°/-多数阳性微产气,少数阴性。
      大肠杆菌检验程序图解
                        -----
                        |供试品|
                        -----
                            ↓稀释
                        -----
                        |供试液|
                        -----
                            ↓
                    --------
                    |胆盐乳糖增菌|
                    --------
                  37°↓18—24小时
                ------------
                |MacC平板或EMB|
                ------------
                  37°↓18—24小时
                      -----
                      |纯培养|
                      -----
                  37°↓18-24小时
                    -------
                    |染色、镜检|
                    -------
                          ↓
              ---------------
              ↓                          ↓
    ---------                ------
    |IMViC试验|                |乳糖发酵|
    ---------                ------
              |                          |
              ---------------
                          ↓
                      -----
                      |报  告|
                      -----
    (一)增菌培养:
    取供试液10毫升,接种于备妥的100毫升胆盐乳糖增菌液内。置37°培养18—24小时,进行增菌。
    (二)分离培养:
    将上述增菌培养物,划线接种于麦康凯琼脂(MacC)或伊红美兰(EMB)琼脂平板上,置37°培养18—24小时,检查有无疑似大肠杆菌菌落。大肠杆菌在麦康凯平板上的典型菌落呈鲜艳的桃红、粉红色;在伊红美兰平板上的典型菌落呈紫黑色,圆形,边缘整齐,表面光滑
湿润,常有金属光泽。由于药物影响,亦呈现紫色、粉紫、中心灰紫、无黑心、湿润等,常为大肠杆菌,均应注意挑选。
    (三)纯培养:
    至少挑选2—3个疑似大肠杆菌菌落,分别接种于肉汤琼脂斜面或三糖(双糖)铁琼脂斜面,置37°培养18—24小时。
    (四)染色镜检:
    将疑似大肠杆菌的纯培养物涂片、革兰氏染色。经染色镜检证明,为革兰氏阴性短杆菌者,应继续做生化试验。
    (五)生化试验:
    1.乳糖发酵试验
    将上述纯培养物接种于乳糖发酵管,置37°培养24—48小时,凡大肠杆菌,可发酵乳糖产酸产气,或产酸不产气时,加用酸性复红指示剂的应显红色;加BTB指示剂时显蓝色。产气者,倒管内有气泡。
    2.IMViC试验:
    ①靛基质试验:将纯培养物接种于蛋白胨水,置37°培养24—48小时,沿管壁加柯凡克氏试剂0.3—0.5毫升,轻微摇动,静置片刻,观察液面。阳性反应,液面呈玫瑰红色;阴性反应液面呈试剂本色。
    ②甲基红试验:将纯培养的菌苔接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基内,置37℃培养24—48小时,加入甲基红试剂数滴,观察结果。阳性反应呈鲜红色或桔红色;阴性反应呈黄色。
    ③V—P试验:将纯培养物接种于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基内,置37°培养48小时,按培立脱法先加6%a-萘酚无水乙醇溶液1毫升,再加40%的氢氧化钾溶液0.4毫升,轻摇后观察结果。阳性反应,加入试剂后,应在15分钟内显红色、深红色。如不明显,可延长至
4小时。
    ④枸橼酸盐利用试验:将纯培养的菌苔接种于西蒙氏枸橼酸盐琼脂斜面,37°培养24小时,观察结果。阳性反应,斜面有菌苔生长,培养基由绿色变为蓝色。阴性反应斜面无菌苔生长,培养基仍为绿色。当见有微量或痕迹生长的可疑现象时,应将待检菌株分离,纯化后再行试验。

    (六)供试品检验报告:
    供试品增菌后,在麦康凯或伊红美兰琼脂平板上分离的疑似大肠杆菌,经证实为革兰氏阴性短杆菌,乳糖发酵试验阳性,IMViC试验呈++--或-+--反应者,应即报告供试品检出大肠杆菌。〔注〕
    大肠杆菌及其他致病菌检查按一次检出结果为准,不再抽样复试。
    〔注〕关于大肠杆菌的IMViC反应的说明
    大肠杆菌IMViC试验的模式反应,在一般情况下应为“++--”或将“-+--”也包括在内,共代表了绝大多数大肠杆菌(占99%)的实际反应结果,因而受到了国际上的广泛承认,并将其列为大肠杆菌的常规鉴别IMViC反应公式。但个别大肠杆菌的IMViC反应,
也可能出现“+---”和“++-+”等等异常现象。由于这种异常反应出现的频率极少,没有普遍性的代表意义,因而在分类鉴别和统计学上,可以忽略不计。
    四、沙门氏菌检验法
    沙门氏菌主要寄生在人体、哺乳动物和家禽的肠道内,可随同粪便的排泄污染水源,食品与药品。沙门氏菌的种类繁多,有些对人有致病力,如伤寒沙门菌和副伤寒沙门氏菌;有些对动物有致病力,如鸭沙门氏菌和雏沙门氏菌;尚有一些对人和动物皆有致病力,如肠炎沙门氏菌、鼠伤
寒沙门氏菌和猪霍乱沙门氏菌等。它们能引起人类伤寒症、急性胃肠炎和败血症等。
    带有这些细菌的人与动物常可直接或间接地污染药品的生产环境、工具设备和原料辅料,以及半成品和成品等。特别是用动物脏器制成的药品,污染机率较高,影响患者用药安全,并有可能通过药品的流通而传播。故将沙门氏菌,应列为某些药品的必检项目。
    沙门氏菌检验程序。
      沙门氏菌检验程序图解
                        -----
                        |供试品|
                        -----
                            ↓稀释
                        -----
                        |供试液|
                        -----
                            ↓
                    ----------
                    |胆盐乳糖增菌培养|
                    ----------
                    37°↓18—24小时
                    ----------
                    |SS与EMB平板|
                    ----------
                    37°↓18—24小时
                      -------
                      |三糖铁琼脂|
                      -------
                    37°↓18—24小时
        -------------------------
        |      |      |                              |
      ---  ---  ---                  -------------
      |动|  |镜|  |凝|                  |    一般生化反应      |
      |  |  |  |  |集|                  |-----------|
      |  |  |  |  |试|                  |葡乳麦甘蔗靛硫尿赖脱氰|
      |力|  |检|  |验|                  |萄  芽露  基化素氨羧化|
      |  |  |  |  |  |                  |糖糖糖醇糖质氢酶酸酶钾|
      ---  ---  ---                  -------------
        |      |      |                              |
        -------------------------
                            ↓
                        -----
                        |报  告|
                        -----
    (一)增菌培养:
    取1∶10供试品稀释液10毫升,接种于备妥的100毫升胆盐乳糖增菌液内。置37°培养18—24小时,进行增菌。
    (二)分离培养:
    取上述增菌培养物,划线接种于SS琼脂和EMB琼脂平板各一个(划线时,适当增加SS琼脂平板的涂抹量2—3环,可提高阳检率),置37°培养18—24小时。凡沙门氏菌,在SS和EMB琼脂平板上,菌落一般无色透明或半透明,圆形,周边整齐,表面光滑湿润,在SS
琼脂平板上中心有时呈黑褐色。如有上述疑似菌落,应选取2—3个分别进行纯培养,按下列方法鉴别。
    (三)初步鉴别:
    将上述纯培养物分别穿刺并划线接种三糖铁(TSI)琼脂,置37°培养18—24小时。凡在TSI琼脂中不分解乳糖及蔗糖(即上部斜面呈碱性,不变色),下层底部分解葡萄糖呈酸性变黄色(有气泡或无气泡),有动力或无动力,以及产生或不产生黑褐色的硫化氢反应,并经
涂片染色镜检为革兰氏阴性杆菌,都应继续做生化试验和血清学检查。
    (四)生化试验:
    取上述疑似菌落的纯培养物、分别接种至葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇和蔗糖等发酵管培养基,并接种蛋白胨水和尿素培养基,经37°培养2—5天,观察结果。沙门氏菌一般生化反应和动力检查,绝大数应为、葡萄糖+,乳糖-,麦芽糖+,甘露醇+,蔗糖-,靛基质-,硫化
氢+,尿素酶-,动力+。当一般生化试验符合时,应做赖氨酸脱羧酶及氰化钾试验。沙门氏菌赖氨酸脱羧酶试验+,氰化钾-。系统生化试验,详见表2:肠杆菌科各菌属的生化特性鉴别表。
    (五)动力试验:
    取上述纯培养物穿刺接种半固体培养基,于37°培养24小时后,观察动力表现。无动力表现的培养物,应在室温(25°左右)保留2—3天后,再观察。
    (六)血清学检查:
    取上述疑似菌落的TSI琼脂培养物少许,与沙门氏菌A—F多价O血清作玻片凝集试验,并以生理盐水作对照试验。若凝集试验为阴性反应时,应将菌苔制成浓菌液在100℃水浴中保温30分钟后再进行A—F多价O血清凝集试验。将反应结果,结合生化试验,判定之。
    (七)供试品检验报告:
      凡菌落形态与初步鉴定符合下列情况分别报告如下:
-----------------------------------------
              血  清  |      A—F多      |生理|  一般|
                      |      价O血清      |    |      |
-----------|----------|盐水|  生化|        报告
        待  检  菌    |        |  100°|    |      |
-----------|  菌苔  |  03′  |对照|  反应|
  顺  序              |        |          |    |      |
-----------|----|-----|--|---|-----------
        1            |  +    |          | - |  符合|检出沙门氏菌
                      |        |          |    |      |
        2            |  +    |          | - |不符合|转有关部门进一步检定
                      |        |          |    |      |
        3            |  -    |    +    | - |  符合|检出沙门氏菌
                      |        |          |    |      |
        4            |  -    |    +    |-  |不符合|转有关部门进一步检定
                      |        |          |    |      |
        5            |  -    |    -    |-  |不符合|未检出沙门氏菌
                      |        |          |    |      |
        6            |  -    |    -    |-  |  符合|转有关部门进一步检定
-----------------------------------------
    五、绿脓杆菌检验法
    假单胞菌属的绿脓杆菌对人类有致病力,同药品卫生有关。特别在大面积的烧伤、烫伤患者,眼科疾病和其他外伤方面,常因感染绿脓菌后病情加重,造成患者伤处化脓,并可引起菌血症等,眼角膜溃疡甚至失明,损害病人健康。因此一般眼科制剂和外伤用药,规定不得检出绿脓杆菌

    绿脓杆菌检验程序(见次页)。
    绿脓杆菌和其他革兰氏阴性杆菌的主要特性鉴别见表3。
    (一)增菌培养:
    取供试液10毫升,接种于备妥的100毫升胆盐乳糖培养液内,置37°培养18—24小时。
    增菌后,如有绿脓杆菌生长,液体表面多有一层薄菌膜,培养液常呈黄绿色或蓝绿色。
    一般滴眼剂如为抗生素或有抑菌作用的供试品,取样4毫升,用滤膜法处理后,将薄膜分成4片,分别接入100毫升的胆盐乳糖增菌液两瓶中,其中一瓶接阳性菌作对照。置37°培养18—24小时。
    (二)分离培养:
    取上述增菌培养物(应尽量从培养液的薄菌膜部位挑取),划线在十六烷三甲基溴化铵或明胶十六烷三甲基溴化铵琼脂平板上,置37°培养18—24小时。
    凡绿脓杆菌在十六烷三甲基溴化铵平板上或在明胶十六烷三甲基溴化铵平板上其菌落扁平无定形周边扩散或略有蔓延,表面湿润,菌落呈灰白色,菌落周围培养基常扩散有水溶性蓝绿色色素,在含有明胶平板上除上述形态外,菌落周围呈现明胶液化环。
    挑取疑似绿脓杆菌菌落2—3个进行纯培养。
    (三)染色镜检:
    挑取疑似菌落纯培养物、涂片、革兰氏染色,经镜检为阴性杆菌者,应进行氧化酶试验。
    (四)生化试验
    1.氧化酶试验
    取一小块白色洁净的滤纸片放在平皿内,用无菌玻璃棒挑取绿脓杆菌疑似菌落的纯培养物,涂在滤纸片上,然后滴加一滴新鲜配制的1%二甲基对苯二胺盐酸盐试液于培养物上,在30秒钟之内,纸片上的待检培养物出现粉红色,并逐渐变为紫红色时,即为氧化酶试验阳性。若培养物
不变色,氧化酶试验阴性,供试品可按未检出绿脓杆菌报告。
    
    
    2.绿脓菌素试验:
    挑取纯培养物分别接种在专供测定绿脓菌素用的PDP琼脂斜面培养基上,置37°培养24小时后,在试管内加氯仿3—5毫升,充分振摇,将琼脂斜面培养物中的待检色素提取在氯仿液里。待氯仿提取液呈蓝绿色时,用吸管将其移到另一试管中,并在该液中加1N的盐酸1毫升左
右,振摇后,静置片刻,如果在上层的盐酸液内出现粉红色时,即为阳性,表明被检菌的培养物中有绿脓菌素存在。如阴性,应继续将纯培养物接种在PDP琼脂斜面上,37°培养2—3天后,检查有无绿脓杆菌素产生。
    3.硝酸盐还原产气试验:
      绿脓杆菌检验程序图解
                        -----
                        |供试品|
                        -----
                            ↓
                        -----
                        |供试液|
                        -----
                            ↓
                      --------
                      |胆盐乳糖增菌|
                      --------
                    37°  ↓18—24小时
                ---------------
                |十六烷三甲基溴化铵平板或明|
                |胶十六烷三甲基溴化铵平板  |
                ---------------
                    37°  ↓18—24小时
                        -----
                        |纯培养|
                        -----
                            ↓
                      -------
                      |染色、镜检|
                      -------
                            ↓
                      -------
                      |氧化酶试验|
                      -------
                            |
    (-)  --------------------  (+)
            ↓                                    ↓
      阴    性                              --------
            ↓                              |绿脓菌素试验|
        -----                          --------
        |报  告|                  (一)      ↓        (+)
        -----                        ------------
                                              ↓                ↓
              -----------------            -----
              ↓              ↓              ↓            |报  告|
                                                            -----
          ------    -------    ---------
          |明胶液化|    |硝酸盐还原|    |42°生长试验|
          |  试验  |    |产气试验  |    |              |
          ------    -------    ---------
              |                  |                    |
              ----------------------
                                  ↓
                              -----
                              |报  告|
                              -----
      表3  绿脓杆菌和其他革兰氏阴性杆菌的主要特性鉴别表
---------------------------------------------------
                      |分离  |        色素          |    |  |  |      |    |      |  |
    鉴  别  培  养    |---|-----------|    |氧|氧|      |精解|硝  产|  |42
                      |      |      |      |      |鞭  |化|  |  乙  |氨  |酸    |液|生
-----------|十六烷|  绿  |  萤  |  其  |毛  |葡|化|  酰  |酸  |盐    |化|长
                      |三甲基|  脓  |  光  |  他  |染  |萄|  |  氨  |双  |还    |明|试
    菌          种    |溴化铵|  菌  |  色  |  色  |色  |糖|酶|  酶  |水酶|原  气|胶|验
                      |琼脂  |  素  |  素  |  素  |    |  |  |      |    |      |  |
-----------|---|---|---|---|--|-|-|---|--|---|-|---
绿脓杆菌              |  +  |+/-|+/  |+/-|端极|+|+|  +  |+  |  +  |+|+
(P. aeruginosa)       |      |      |      |      |单毛|  |  |      |    |      |  |
-----------|---|---|---|---|--|-|-|---|--|---|-|---
萤光假单胞菌          |-/+|  -  |+/-|  -  |端极|+|+|-/+|+  |-/+|+|-
(P. fluorescens)      |      |      |      |      |多毛|  |  |      |    |      |  |
-----------|---|---|---|---|--|-|-|---|--|---|-|---
恶臭假单胞菌          |-/+|  -  |+/-|  -  |”  |+|+|-/+|+  |  -  |-|-
(P. putida)           |      |      |      |      |    |  |  |      |    |      |  |
-----------|---|---|---|---|--|-|-|---|--|---|-|---
洋葱假单胞菌          |+/-|  -  |  -  |-/+|”  |+|+|  +  |-  |  -  |+|+/-
(P. cepacia)          |      |      |      |      |    |  |  |      |    |      |  |
-----------|---|---|---|---|--|-|-|---|--|---|-|---
伪鼻疽假单胞菌        |  -  |  -  |  -  |  -  |”  |+|+|  -  |+  |  -  |+|+
(P. pseudomallei)     |      |      |      |      |    |  |  |      |    |      |  |
-----------|---|---|---|---|--|-|-|---|--|---|-|---
嗜麦芽假单胞菌        |  -  |  -  |  -  |  -  |”  |+|-|  -  |-  |  -  |+|+/-
(P. malfophilia)      |      |      |      |      |    |  |  |      |    |      |  |
-----------|---|---|---|---|--|-|-|---|--|---|-|---
腐败假单胞菌          |  -  |  -  |  -  |  -  |端极|+|+|  -  |-  |  -  |+|-/+
(P. putrefaciens)     |      |      |      |      |单毛|  |  |      |    |      |  |
-----------|---|---|---|---|--|-|-|---|--|---|-|---
司塔泽单假胞菌        |  -  |  -  |  -  |  -  |端极|+|+|  -  |-  |  +  |+|+
(P. stutzeri)         |      |      |      |      |单毛|  |  |      |    |      |  |
---------------------------------------------------
---------------------------------------------------
产碱假单胞菌          |  -  |  -  |  -  |  -  |”  |-|+|  -  |-  |  -  |-|+
(P. alcaligenes)      |      |      |      |      |    |  |  |      |    |      |  |
-----------|---|---|---|---|--|-|-|---|--|---|-|---
类产碱假单胞菌        |  -  |  -  |  -  |  -  |”  |-|+|  -  |-  |  -  |-|+
(P. pseudoaloaligenes)|      |      |      |      |    |  |  |      |    |      |  |
-----------|---|---|---|---|--|-|-|---|--|---|-|---
氧化木糖无色杆菌      |  +  |  -  |  -  |  -  |周毛|+|+|  +  |-  |  +  |-|+
(A. xylosoxidans)     |      |      |      |      |    |  |  |      |    |      |  |
-----------|---|---|---|---|--|-|-|---|--|---|-|---
产碱杆菌属            |-/+|  -  |  -  |  -  |”  |-|+|-/+|-  |-/+|-|+
(Alcaligenes. SP.)    |      |      |      |      |    |  |  |      |    |      |  |
-----------|---|---|---|---|--|-|-|---|--|---|-|---
粪产碱杆菌            |  +  |  -  |  -  |  -  |”  |-|+|  +  |-  |-/+|-|+
(A. faecalis)         |      |      |      |      |    |  |  |      |    |      |  |
---------------------------------------------------
    
    注:+/-表示多阳性,多阴性,-/+表示多阴性,少阳性。
    挑取纯培养物,接种在硝酸盐胨水培养基中,置37°培养24小时观察结果。凡在硝酸盐胨水培养基内的小倒管中有气体产生者,即为阳性反应,表明该菌能还原硝酸盐,并将亚硝酸盐分解产生氮气。
    4.明胶液化试验:
    取上述绿脓杆菌疑似菌落的纯培养物,分别穿刺接种在明胶培养基内,置37°培养24小时,取出放冰箱内10—30分钟,如仍呈溶解状,即为明胶液化试验阳性。如凝固不溶者,为阴性反应。
    (四)42°生长试验:
    挑取纯培养物,分别接种在肉汤琼脂斜面上,放在41°±1°培养箱中培养24—48小时,凡绿脓杆菌应能发育生长。
    (五)供试品检验报告:
    凡在上述平板上分离出的疑似绿脓杆菌菌落,经证实为革兰氏阴性杆菌,氧化酶和绿脓菌素试验同为阳性者,即可报告供试品检出绿脓杆菌。如果绿脓菌素试验阴性,则须液化明胶,硝酸盐还原产气和42°生长试验三者皆为阳性时,可报告供试品检出绿脓杆菌。
    六、金黄色葡萄球菌检验法
    金黄色葡萄状球菌在自然界分布较广,常可污染药品及食品,是葡萄状球菌中对人类致病力最强的一种,能引起人体局部化脓性病灶,严重时可导致败血症。某些溶血性菌株尚可产生耐热性的肠毒素,加热到100°30分钟毒素不致破坏,有时细菌已被杀死,毒素仍然存在,以致引
起急性胃肠炎,是人类食物中毒症的常见病因之一。因此,目前规定,凡外用药和眼科制剂不得检出金黄色葡萄球菌。
    金黄色葡萄球菌检验程序。
    (一)增菌培养:
    取供试液10毫升,接种于备妥的100毫升肉汤培养基或北沙参胨水培养基中。上述两种培养基亦可加亚碲酸钠。置37°培养24小时。
    一般滴眼剂如为抗生素或有抑菌作用的供试品,取样4毫升,用滤膜法处理后,将薄膜分成4片,分别接入100毫升亚碲酸钠肉汤或北参沙胨水培养基两瓶中,其中一瓶接阳性菌作为对照。置37°培养18—24小时。
    (二)分离培养:
    将上述增菌培养液摇匀后,取1—2环在卵黄高盐琼脂、或在血琼脂、TMP琼脂及TMP北沙参琼脂平板上,划线后置37°培养24—72小时。金黄色葡萄球菌在上述各琼脂平板上的菌落形态见表4。
      表4  金黄色葡萄球菌在选择培养基上的菌落特征
-------------------------------------
      培  养  基        |        菌  落  形  态  特  征
------------|------------------------
  1.卵黄高盐琼脂      |金黄色、圆形突起,边缘整齐,外周有卵磷脂被分解
                        |  的乳浊圈。直径约1—2毫米。
------------|------------------------
  2.血琼脂            |金黄色,圆形突起,边缘整齐,外周有透明的溶血环
                        |  (乙型溶血)。直径约1—2毫米。
------------|------------------------
  3.TMP北沙参琼脂*|墨黑色,圆形突起,边缘整齐,外周有黄色环。直径
                        |  约1—1.5毫米。
------------|------------------------
  4.TMP琼脂        |墨黑色,圆形突起,边缘整齐,外周有黄色环。直径
                        |  约0.7—1毫米。
-------------------------------------
注:*应取增菌培养物3—5环划线分离,以提高检出率。
    (三)纯培养:
    于上述任一分离平板上挑取疑似金黄色葡萄球菌2—3个菌落分别划线接种于肉汤琼脂斜面培养基上,置37°培养18—24小时。其培养物用作染色镜检、甘露醇发酵试验及血浆凝固酶试验。
                        金黄色葡萄球菌检验程序图解
                                -----
                                |供试品|
                                -----
                                    ↓
                                -----
                                |供试液|
                                -----
                                    ↓
                    -------------------
                    ↓37°            24—48小时  ↓
            ---------              ---------
            |  亚碲酸钠肉汤|              |肉汤或北沙参胨|
            |或亚碲酸钠北沙|              |              |
            |参胨水培养基  |              |水培养基      |
            ---------             ----------
                    ↓37°            24—72小时  ↓
            -------------------------
            |  卵黄高盐平板                                |
            |  血琼脂平板                  TMP琼脂平板  |
            |  TMP北沙参高盐琼脂平板                    |
            -------------------------
                                      ↓
                                  -----
                                  |纯培养|
                                  -----
                                37°↓18—24小时
                                  -----
                                  |镜  检|
                                  -----
                                      ↓
                  ----------------------
                  ↓                                        ↓
            -------                          ---------
            |甘露醇发酵|                          |血浆凝固酶试验|
            -------                          ---------
                  |                                        |
                  ----------------------
                                      ↓
                                  -----
                                  |报  告|
                                  -----
    (四)染色镜检:
    挑取纯培养物,经涂片革兰氏染色镜检,金黄色葡萄球菌应为革兰氏阳性球菌,菌体成堆,象葡萄状或少量的散在排列。
    (五)甘露醇发酵
    取上述纯培养物,接种至甘露醇发酵培养基中,置37°培养18—24小时,应能发酵产酸,培养基呈红色。
    (六)血浆凝固酶试验
    1.玻片法:取一片清洁干燥的载玻片,在两边分别滴加灭菌生理盐水和血浆各一大滴。用接种环沾取待检菌的纯培养物,先在盐水滴中、后在血浆滴中充分研磨混合,对照观察反应。凡血浆滴在五分钟内出现团块或颗粒状的凝块时,而盐水滴仍呈均匀混浊状者,可判定血浆凝固酶试
验阳性。若混菌后的血浆滴和盐水滴,都呈均匀混浊状时,则为阴性。凡玻片试验呈阴性反应时,应继续用试管法进行凝固酶试验。
    2.试管法:取灭菌小试管两支,用灭菌吸管吸取血浆原液或1∶1盐水血浆稀试液加在试管中,每管各0.5毫升。然后取待检菌肉汤培养物0.5毫升或琼脂斜面上的纯菌苔,充分混悬在一支血浆管内使呈浓菌液状,另一支血浆管不加菌作为对照。将两支小管同时放在37°培养
箱或水浴箱内保温,3小时开始检查,以后每隔适当时间检查一次,直至24小时。每次取出观察反应,可轻轻将血浆管倾斜,仔细观察。凡不加菌的血浆能流动自如,加菌的血浆凝固者,应判为凝固酶试验阳性。经保温24小时,若加菌的血浆无凝固现象,则为阴性。阳性对照菌凝固酶
试验应为阳性。
    (七)供试品检验报告:
    凡从上述平板上分离的疑似菌落,经染色镜检证明为革兰氏阳性葡萄状球菌,并证实可发酵甘露醇产酸,血浆凝固酶试验阳性者,应报告供试品检出金黄色葡萄球菌。
    七、破伤风杆菌检验法
    破伤风杆菌属于专性厌氧梭状芽孢杆菌属,广泛分布于泥土上层及人和牲畜的粪便中。以根、茎类植物为原料的药品,常可受到污染。本菌为专性厌氧菌,菌体细长,周身有鞭毛,能运动。成熟的芽孢多为正圆形;未成熟的孢芽为卵圆形,位于菌体的顶端,直径大于菌体的宽度。带有
芽孢的菌体形似鼓槌状,是破伤风杆菌的形态特征。本菌为革兰氏染色阳性,但培养较久后常为革兰氏染色阴性。其繁殖体的抵抗力同其它无芽孢菌相似,而芽孢则有高度抵抗力,经湿热100°;干热150°一小时尚能存活,在尘埃或土壤中可数年不死。
    破伤风病主要由破伤风杆菌的外毒素——神经毒素引起的,这种毒素有选择性地作用于神经系统,特别是能引起脊髓前角细胞中毒,从而发生伸肌痉挛性收缩,呈角弓反张强直状态的破伤风特有的抽搐症状。因此,用于深部组织、创伤和溃疡面的外用制剂不得检出破伤风杆菌。
    (一)增菌产毒培养:
    以无菌手续取供试品约0.1g共3份,分别加至0.1%葡萄糖庖肉培养基中(用前煮沸5分钟,迅速冷却),其中一管加0.05ml(或少许)经37°培养2-3天的阳性菌。置75-80°水浴保温20分钟,然后置适宜的厌氧条件下(厌氧培养箱、厌氧袋、厌氧罐或分别
加入凡士林石蜡等量混合液,将液面盖住),于35-37°培养3-4天。如有厌氧菌生长,可产气、消化碎肉并有特殊臭气。具有上述现象之一者,应涂片作革兰氏染色镜检,分离培养并作毒力试验。若染色镜检发现具有破伤风杆菌芽孢形态,但毒力试验为阴性时,需将增菌液转种至
0.1%葡萄糖庖肉培养基内,并同时在新霉素葡萄糖血平板上进行分离培养1-2次,以提高毒力。
    
    (二)分离培养:
    取上述可疑增菌液(镜检阳性而毒力试验阴性者),接种新霉素葡萄糖血平板2-3个,置厌氧条件下(同前),于37°培养3-4天,破伤风杆菌在此血平板上,菌落一般为蔓延生长似雾状、细丝状或呈细小,中心略突,边缘有细微样延展等多种类型,常见有β-溶血。
    (三)毒力试验:
    选用16-18g或18-22g同性无孕的健康小白鼠3-5只,于后腿内侧皮下(肌肉)或背侧颈部皮下注射增菌液0.3-0.5ml,注射后6小时即可开始观察发病情况至48小时。
    为证实小白鼠是否由破伤风外毒素引起的破伤风症状,应同时做破伤风抗毒素保护试验。
                          破伤风杆菌检验程序
                              -----
                              |供试品|
                              -----
                        75-80°↓20′
                          ---------
                          |厌  氧  培  养|
                          ---------
                        35-37°↓72-96h.
                    ---------------
                    |产气  消化碎肉  镜检阳性  |
                    |        并有臭气          |
                    ---------------
                                  ↓
                              -----------------
                            +↓                              ↓-
                    ---------                    ------
                    ↓              ↓                    |报告阴性|
                ------      ------            ------
                |毒力试验|      |分离培养|
                ------      ------
                      ↓    35-37°↓ 厌氧培养72-96h.
                  -------                          ------
                +↓          ↓-      --------→|疑似菌落|
              ------    -----                  ------
              |报告阳性|    |转  种|                      ↓
              ------    -----                  -----
                         35-37°↓厌氧培养72h.|纯  培  养|
                              ------              ------
                              |毒力试验|                  ↓
                              ------                ------
                                ↓                        |毒力试验|
                        ---------                ------
                    +  ↓              ↓-                  ↓
                    ------      ------            ---------
                    |报告阳性|      |转    种|          +↓              ↓-
                    ------      ------        ------    ------
                                      35-↓厌氧培养    |报告阳性|    |报告阴性|
                                      37°  72h.    ------    ------
                                      ------
                                      |毒力试验|
                                      ------
                                            ↓
                                  -----------
                                +↓                  ↓-
                              ------        ------
                              |报告阳性|        |报告阴性|
                              ------        ------
    以注射用水稀释破伤风抗毒素使每毫升含120单位,取0.3-0.5ml和供试品增菌液0.3-0.5ml,同时给小白鼠注射,或先注射抗毒素,再于半小时内注射增菌液。
    (四)供试品检验报告:
    凡供试品经增菌产毒培养后,涂片染色镜检为典型破伤风杆菌,并经毒力试验为阳性,应报告供试品检出破伤风杆菌。若镜检未发现典型破伤风杆菌,而毒力试验为阳性,也应按阳性结果报告。如毒力试验和镜检均为阴性时则报告为阴性结果。若经增毒培养后,毒力试验阴性而镜检虽
为阳性时,则报告为阴性结果。(注意事项:凡从事破伤风杆菌检验的人员,应注射破伤风类毒素。作毒力试验时要戴手套。所用的物品必须经高压灭菌后洗涤)
    八、活螨检验法
    螨,属于节肢动物门,蜘蛛纲,蜱螨目,种类繁多,分布甚广。其生活习性各异,营自由生活或寄生生活。在土壤、池沼和江河湖海里,动、植物体上,储藏食品和药品中,都有它们的存在。体形微小,多在一毫米以下。一般呈圆形或卵圆形,头胸腹分界不明显。幼螨足三对,成螨足
多数为四对,足由六节组成。口器向前端突出,螯肢常呈螯钳状,有齿。须肢节数因种类而异,由一~二节到五节组成,一般呈爪或钳状,偶尔为长形。有些种类在躯体前端背面或两侧有一~二对眼。呼吸通过气管或体壁进行。躯体两侧对称,表面被有坚硬的几丁质的板,保护其内部器官
和支持肌肉固定。体表有刚毛,它的形状、数目及彼此间长短比例和排列位置因种类而异,在分类上有重要意义。
    螨可蛀蚀损坏药品,使药品变质失效,并可直接危害人体健康或传播疾病。例如,中成药中发现的腐食酪螨,对人具有致病力。一种是引起皮炎,另一种是引起消化系统、泌尿系统及呼吸系统的疾病。因此,用于口服、创伤、粘膜和腔道的药品,不得检出活螨。
    供试品取样量:每批取两瓶或两盒以上的包装单位;贵重或微量包装的供试品,取样量可酌减。
    (一)活螨的一般检验法
    1.直检法:取供试品先用肉眼观察,有无疑似活螨的白点,再用5-10倍放大镜或双筒实体显微镜检视,有螨者,用解剖针或粘在铜(或铁)丝上的头发丝或小毛笔挑取,活螨放在滴有一滴甘油水(甘油与水1∶4混合而成,下同)的载玻片上,置显微镜下观察。
    2.漂浮法:将供试品放在盛有饱和食盐水的扁形称量瓶或适宜的容器内,加饱和食盐水至容器的三分之二处,搅拌均匀,置双筒实体显微镜下检查,或继续加饱和食盐水至瓶口处(为防止盐水同样品溢出污染桌面,宜将上述容器放在装有适量甘油水的培养皿中),用载玻片沾取水面
上的漂浮物,置显微镜下检查有无活螨。
    3.分离法:也称烤螨法。将供试品放在特制的分离器或者附有孔径大小适宜的筛网的普通玻璃漏斗里,利用活螨避光,怕热的习性,在漏斗的广口上面放一个60-100瓦的灯泡,距离药品约6厘米处,照射1-2小时。活螨可沿着漏斗内的底部细颈内壁向下爬,可用小烧杯装半
杯甘油水,放在漏斗的下口处,收集爬出来的活螨。
    (二)各剂型药品的活螨检验法
    1.大蜜丸:将药丸外壳(蜡壳或纸蜡壳等)置酒精灯小火焰上转动,适当烧灼(杀灭壳外可能污染的活螨)后,小心打开。
    (1)表面完好的药丸,可用消毒的解剖针刺入药丸,手持解剖针,在放大镜或双筒实体显微镜下检查。同时注意检查丸壳的内壁或包丸的油纸有无活螨。
    (2)有虫粉现象的药丸,也可用放大镜、双筒实体显微镜直接观察,或有漂浮法检查。
    2.小蜜丸、水丸和片剂:
    (1)表面完好的丸、片,可将药品放在预先衬有洁净黑纸的培养皿或小搪瓷盘中,用直检法检查。如未检出螨时,可再用漂浮法或烤螨法检查。
    (2)有虫粉现象的丸、片,也可用直检法或漂浮法检查。
    同时注意检查药瓶内壁与内盖有无活螨。
    3.散剂、冲服剂和胶囊等:先直接检查药瓶内盖及塑料薄膜袋的内侧有无活螨。后将药品放在衬有洁净黑纸的搪瓷盘里,使成薄层,直接检查。检不出螨时,再用漂浮法。并注意检查药瓶内壁是否有螨。
    4.块状冲剂:直接检查供试品的包装蜡纸、玻璃纸或塑料薄膜及药块表面有无活螨。有虫粉现象者,也可用漂浮法检查。
    5.液体制剂及半流体浸膏:先用75%乙醇将药瓶的外盖螺口周围消毒后,小心旋开外盖,用直检法,检查药瓶外盖的内侧及瓶口内外的周围与内盖有无活螨。
    附1.螨标本的制作:
    (1)临时标本:将检出的活螨挑放在滴有一滴75%乳酸的载玻片上,加上盖玻片,手持载玻片,在酒精灯小火焰上来回移动,缓缓加热片刻后,即可镜检。鉴定后的螨体,可取下放入70%乙醇中保存,或适当处理。
    (2)长期标本:用解剖针或粘在铜(或铁)丝上的头发丝或小毛笔轻缓仔细地挑取螨体1-2只,放在滴有一滴清水的载玻片上,洗去杂质,取出放在滴有封固液的载玻片上,在放大镜或双筒实体显微镜下进行整姿后,加上盖玻片,在酒精灯小火焰上适当加热,促使螨体附肢伸展。
置50-60°烘箱中数日,干燥即得。也可在盖玻片周围用加拿大树胶封固,然后在载玻片一端贴上标签即可。
    附2.螨类封固液常用配方及其制法:
    (1)水合氯醛  70克  阿拉伯胶粉8克
      冰醋酸  3毫升  甘油  5毫升
      麝香草酚  1克  蒸馏水  10毫升
    先将阿拉伯胶、水合氯醛及蒸馏水置乳钵中,充分研磨,使完全溶解。然后加入冰醋酸、甘油和麝香草酚,再充分混合,用双层纱布滤过,静置一周后,取其上层澄清液装在棕色滴瓶内备用。
    (2)水合氯醛  200克  阿拉伯胶粉30克
      甘油  20克  蒸馏水  50毫升
    将阿拉伯胶粉倒入烧杯内,加入蒸馏水,随加随搅拌,直至阿拉伯胶溶解,置水浴加热至40-50°,加入水合氯醛溶解后,加入甘油混匀,抽气滤过,装入棕色滴瓶内备用。
  
          第三章  附  录
    一、稀释剂
    1.生理盐水
    (1)成份:
    氯化钠(NaCl)                    8.5克
    蒸馏水                            1000毫升
    (2)制法:
    取氯化钠,加水溶解,分装瓶内后15磅20分
钟灭菌即得。
    (3)用途:供稀释供试品用。
    2.0.1M磷酸盐缓冲液
    (1)成份:
    磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)
                                        25.8克
    磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)
                                          4.4克
    蒸馏水                            1000毫升
    (2)制法:
    混合以上成份,搅拌使溶,PH应为7.1-7.3,
分装,15磅20分钟灭菌。
    (3)用途:供稀释供试品用。
    二、常用试剂和指示剂
    (二)常备试剂和用法
    1.甲基红试剂(M·R反应测定用)
    0.02%甲基红乙醇溶液:
    甲基红                                0.1克
    95%乙醇                          300毫升
    蒸馏水                              200毫升
    
    
    用法:接种细菌于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基内,经37°培养48小时。加入甲基红试剂数滴于上述培养物中,观察结果。如阳性为红色,桔红色,阴性为黄色。
    2.培立脱氏试剂(V·P反应测定用)
    甲液:6%α ̄萘酚无水乙醇溶液:
    取α ̄萘酚6克,溶于无水乙醇100毫升。
    乙液:40%氢氧化钾溶液:
    取氢氧化钾40克,加蒸馏水至100毫升。
    用法:接种细菌于磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基内,经37°培养48小时,先加甲液约1毫升,再加乙液0.4毫升,15分钟至4小时内如显红色为阳性反应。
    3.靛基质试剂
    柯凡克氏试剂:
    纯戊醇                              150毫升
    对二甲氨基苯甲醛                        10克
    纯浓盐酸                              50毫升
    
    
    将对二甲氨基苯甲醛加入纯戊醇中,搅动使其完全溶化,将纯浓盐酸一滴一滴地徐徐加入,边加边摇,不能加得太快,以免发生骤热使溶液颜色变深。此试剂应小量配制,保存于冰箱内备用。
    用法:接种细菌于蛋白胨水培养基内,于37°培养24-48小时。沿管壁加柯凡克氏试剂约0.3-0.5毫升,并轻轻摇动,若液面显玫瑰红色为阳性。
    4.4/30000虎红溶液:
    取虎红(又称四氯四碘萤光素或孟加拉红)0.1克,加蒸馏水至750毫升即得。
    5.1%2、3、5一氯化三苯基四氮唑(TTC)溶液:
    称取TTC0.1克,加蒸馏水10毫升溶解,10磅30分钟灭菌。
    6.0.1%煌绿溶液:
    称取煌绿0.1克加水100毫升,溶解即得。本液配制后宜10天内使用,日久失效。
    7.1%亚碲酸钠(钾)溶液:
    ①精密称取亚碲酸钠1克,加至100毫升新鲜煮沸并冷至50°的蒸馏水中,溶解即得。
    ②精密称取亚碲酸钠1克,加至100毫升PH7.4灭菌的50°的蒸馏水中,溶解即得。
    8.  20%尿素无菌溶液:
    称取尿素20克,加水至100毫升,充分摇匀,使其溶解。用除菌器过滤,分装灭菌容器中即得。如无除菌设备,可按无菌操作手续取尿素20克,加无菌水至100毫升,并加入麝香草酚1克,在室温放置1-2天即可使用。
    (二)常用的指示剂
    1.0.5%酸性复红:
    称酸性复(品)红0.5克,用100毫升蒸馏水溶解后,加入1N氢氧化钠约16毫升至浅棕色。并不断振摇。于沸水浴内保持15分钟。静置2小时,用滤纸过滤。滤液保存暗处备用。(变色范围PH6.0-7.4)。
    2.0.2%和0.02%酚红:
    称酚红0.5克研细,加1N氢氧化钠1.43毫升使呈桔红色。加蒸馏水至250毫升使溶,即0.2%的酚红液,可作为尿素培养基的指示剂用。
    若将0.2%酚红用新鲜蒸馏水稀释10倍,即为0.02%酚红液,可供测PH用。
    3.  1%酚红水溶液:
    称取酚红1克研细,加1N氢氧化钠液2.86毫升,使呈红色,再加蒸馏水至100毫升,使完全溶解后,分装在棕色试剂瓶内,可供培养基做指示剂用。
    4.  10%碱性复(品)红乙醇饱和溶液:
    称碱性复红10克研细,加95%的乙醇100毫升,放置过夜,滤纸过滤即得(密闭保存)。
    5.  0.4%和0.04%溴麝香草酚兰(又称B.T.B):
    称溴麝香草酚兰0.4克加1N氢氧化钠0.64毫升研磨,加蒸馏水至100毫升即得。
    若将0.4%溴麝香草酚兰加蒸馏水稀释10倍,即为0.04%,可供测定PH用(变色范围PH6.0-7.6)。
    6.0.2%和0.5%亚甲(美)兰:
    称亚甲兰0.2克,加蒸馏水至100毫升,溶解,即为0.2%;如称亚甲兰0.5克,加蒸馏水至100毫升,溶解,即为0.5%。
    7.  1%中性红:
    称中性红1克研细,加95%的乙醇60毫升,溶解,加蒸馏水至100毫升即得。
    8.  2%伊红(曙红  Y):
    称伊红2克,加蒸馏水至100毫升,溶解,即得。
    三、常用染色液及染色法
    (一)革兰氏染色法:
    1.染液制备:
    ①结晶紫液
    甲液:
    结晶紫                                    2克
    95%乙醇                            20毫升
    乙液:
    草酸铵〔(NH4)2C2O4〕            0.8克
    蒸馏水                                80毫升
    甲乙液相混、静置48小时后使用。此染液较稳
定,在密闭的棕色瓶中可储存数月。
    ②碘液
    碘(I2)片                               1克
    碘化钾(KI)                            2克
    蒸馏水                              300毫升
    
    
    先用3-5毫升蒸馏水溶解碘化钾,再投入碘片,待碘全溶后,加水稀释至300毫升。此染液稳定,在密闭的棕色瓶中可存数月。
    ③脱色液:95%乙醇
    ④复染液:
    (a)沙黄(番红)复染液:取沙黄0.25克,先使溶于95%乙醇10毫升,完全溶解后再加蒸馏水至100毫升即得。
    (b)稀石炭酸复红液:称取碱性复红10克,研细,加95%乙醇100毫升,放置过夜,滤纸过滤。取该液10毫升,加5%石炭酸水溶液90毫升混合,即为石炭酸复红液。再取此液10毫升加水90毫升,即成稀石炭酸复红液。
    2.染色方法:
    (1)涂片干燥:
    ①在洁净的载玻片上,用蜡笔划好格,作好有关的注明。
    ②在载玻片上,每个格内滴无菌水或蒸馏水。用接种环挑取少许菌苔,于水滴边缘轻轻涂几下。
    ③自然风干或微热促其快干,干后在火焰上通过2-3次以固定涂片。
    (2)染色步骤:
    ①滴加结晶紫染液,覆盖约1分钟。水洗。
    ②滴加碘液,覆盖约1分钟。水洗。吸干。
    ③滴加95%乙醇液约20-30秒钟。水洗。吸干。
    ④滴加沙黄染液或稀石炭酸复红液复染1分钟。水洗。滤纸吸干。
      (3)染色结果:
    革兰氏阳性菌染成蓝紫色。
    革兰氏阴性菌染成红色。
    3.注意事项:
    ①玻片必须洁净无油,以免影响涂片质量。
    ②涂片的菌量,切不可浓厚,否则,看不清单个菌体形态,且易出现假阳性。
    ③用火焰固定时,不可过热,以载玻片不烫手为宜。过热会影响形态的观察。
    ④一般以检查培养18-24小时的菌为宜。革兰氏阴性细菌的染色反应稳定,不易受菌龄的影响。革兰氏阳性菌的染色反应有的受菌龄的影响;即较幼的细胞,如培养18-24小时或更短的时间呈阳性反应;而较老的细胞,如培养24-48小时以上的细胞则部分或全部细胞转变
为阴性反应。在区分革兰氏染色反应时应注意。
    (二)鞭毛染色法(1)
    1.染液制备:
    20%鞣酸溶液(加温溶解)              2毫升
    钾明矾饱和溶液                          2毫升
    石炭酸饱和溶液                          5毫升
    10%碱性复(品)红液              1.5毫升
    
    按比例将上述溶液混合后,在室温放置2-3日,用滤纸滤清,装在棕色滴瓶内备用。此液配成后五周内使用,不可久存。
    2.染色方法:
    (1)按无菌操作手续,取微量待检菌接种在蛋白胨水培养基中,置37°培养箱内培养6-8小时备用。
    (2)将上述待检菌胨水培养物,轻轻旋转摇匀。用灭菌毛细吸管吸取一滴,加在清洁干燥的载玻片上,将玻片左右摇动,使菌液自然散开,放在室温或37°晾干,使呈一块薄层菌膜。然后在干燥菌膜上滴满染色液,保持1-2分钟,轻轻水洗,干后镜检。如鞭毛着色较浅时,可适
当延长染色时间。
    (3)染色结果,菌体和鞭毛皆呈红色,菌体颜色较深,鞭毛稍淡。染色时间短者鞭毛较细,时间稍长鞭毛较粗,可根据不同情况增减染色时间,以使鞭毛清晰可见。
    鞭毛染色法(2)
    1.染液制备:
    甲液:丹宁酸                              5克
          氯化铁(FeCl3)             1.5克
          福尔马林(15%)            2.0毫升
          氢氧化钠(NaOH)1%      1.0毫升
    乙液:硝酸银(AgNO3)                 2克
          蒸馏水                        100毫升
    
    制备乙液时,待硝酸银溶解后,取出10毫升备用,向余下的90毫升硝酸银液中滴加浓氢氧化铵,先呈很浓厚的沉淀,再继续滴加至刚刚溶解沉淀成澄清液为止。再将备用的硝酸银溶液慢慢逐滴加入澄清液中,先呈现薄雾,但轻摇则消失,继续边滴加边摇动,待澄清液呈现略有轻微
不消散的薄雾状为止。如雾重,则银盐沉淀,不宜使用。
    2.染色方法:
    (1)将待检菌接种在新制备的肉汤琼脂斜面上,置37°培养16-20小时,备用。
    (2)在载玻片的中部相隔一厘米处,用接种环各沾一滴蒸馏水,然后用接种环挑取湿润处的菌苔少许于一端的水滴中,倾斜玻片使培养物流至另一水滴中,两水滴自然相通,菌体从上位自然扩散到下位水滴中,待干燥后染色。
    (3)在干燥涂片上加甲液3-5分钟,用蒸馏水冲洗。将残水沥干或用乙液冲去残水后,加适量乙液保持30-60秒钟。染色时在酒精灯上稍加热,使染液出现蒸汽即可,用蒸馏水冲洗。
    (4)镜检:菌体及鞭毛皆染成茶色。
    3.注意事项:
    (1)染液最好随用随配,存放至次日效果则差。
    (2)一定要充分洗净甲液后再加乙液,否则背景较脏。
    (3)防止水及培养物沾有氯化物。
    (4)切忌用接种环涂抹培养物。
    (5)载玻片一定要洗净。先用洗衣粉煮沸,再水洗,干后放在洗液中,浸泡24小时,取出水洗除去残酸,沥干,存放于95%乙醇中备用。
    (6)加热时最好置金属板上,使载玻片受热均匀。
    (三)芽孢染色法:
    1.染液制备:
    (1)石炭酸复红液:碱性复红4克,溶于95%乙醇100毫升中,再取此液10毫升与5%石炭酸溶液90毫升混匀即成。
    (2)碱性美兰液:美兰2克,溶于95%乙醇100毫升中,再取此液30毫升与0.01%KOH溶液100毫升混匀即成。
    2.染色方法:
    (1)取待检菌芽孢体较多的培养物,涂片、干燥及加热固定后,滴满石炭酸复红液于涂片上,并以弱火加热,使染液冒蒸汽约5分钟。冷后水洗,并用95%乙醇脱色2分钟。水洗,加碱性美兰液复染半分钟。水洗,干后镜检。
    (2)染色结果,芽孢呈红色,菌体为蓝色。
    四、培养基的制法及用途
    1.肉汤培养基:
    (1)成份:牛肉浸液(1∶3)
                                        1000毫升
                蛋白胨                      10克
                氯化钠                        5克
    (2)制法:
    将上述成份微温使溶,用NaOH液调PH为7.4-7.6,煮沸,过滤,分装,15磅20分钟灭菌。
    (3)用途:增菌
    注:牛肉膏3克加蒸馏水1000毫升使溶可代替牛肉浸液(1∶3)1000毫升。
    2.肉汤琼脂培养基:
    (1)成份:牛肉浸液(1∶3)
                                        1000毫升
                蛋白胨                      10克
                氯化钠                        5克
                琼脂                  15-20克
    (2)制法:取胨、氯化钠、琼脂加入肉浸液内,加热,煮沸,待琼脂完全溶化后,混匀,用1NNaOH液调PH为7.4-7.6,过滤,分装,15磅20分钟灭菌。
    (3)用途:细菌总数测定和纯培养用。
    3.0.001%TTC肉汤琼脂培养基(即0.001%2、3、5氯化三苯基四氮唑琼脂培养基):
    (1)成份:牛肉膏                        3克
                蛋白胨                      10克
                氯化钠                        5克
                琼脂                    18-20克
                蒸馏水                  1000毫升
    (2)制法:
    取牛肉膏、蛋白胨、氯化钠加入蒸馏水,微温使溶,用氢氧化钠溶液调PH为7.4-7.6,加琼脂,煮沸熔化,过滤分装。15磅20分钟灭菌。用前将其熔化冷至60°左右加入灭菌的1%2、3、5一氯化三苯基四氮唑(简称TTC或称红四氮唑)水溶液1毫升,摇匀,倾注
平皿。
    (2)用途:细菌总数测定用。
    4.虎红琼脂培养基:
    (1)成份:
          蛋白胨                                  5克
          葡萄糖                                10克
          磷酸二氢钾(KH2PO4)              1克
          硫酸镁(MgSO4·7H2O)      0.5克
          琼  脂                          15-20克
            4
        -----虎红(四氯四碘萤光素)        水溶液
        30000
                                            100毫升
          蒸馏水                            900毫升
    
    
    (2)制法:将蛋白胨、磷酸二氢钾、硫酸镁、琼脂混合,加热使琼脂熔化后加入葡萄糖溶解,过滤,加入虎红(四氯四碘萤光素)水溶液,分装,10磅30分钟灭菌。
    
    
    (3)用途:霉菌总数测定用。
    5.胆盐乳糖(B.L)增菌液:
    (1)成份:
          蛋白胨                              20克
          氯化钠                                5克
          磷酸氢二钾(K2HPO4)              4克
          (或K2HPO4·3H2O         5.2克)
          磷酸二氢钾(KH2PO4)          1.3克
          牛胆盐                            1.3克
          (或去氧胆酸钠                0.25克)
          乳糖                                  5克
          蒸馏水                        1000毫升
    
    
    (2)制法:除乳糖、胆盐(或去氧胆酸钠)外,将上述其它成份混合,微温使溶,用NaOH调PH为7.3-7.4,过滤。加入乳糖、胆盐(或去氧胆酸钠)待溶后,摇匀,分装10磅30分钟灭菌。
    (3)用途:用于大肠杆菌,沙门氏菌和绿脓杆菌的增菌培养。
    注:胆盐是抑菌剂,它对革兰氏阳性菌有良好的抑菌作用,但用量过大,对大肠杆菌亦有轻度抑制作用。每1000毫升培养基中胆盐用量如下:
    牛胆盐,去氧胆酸钠如上述处方量。猪胆盐5克,羊胆盐5克,三号胆盐(Bile  Salt  No.3),五号胆盐1.5克。
    6.伊红美兰(EMB)琼脂:
    (1)成份:
          肉汤琼脂(PH7.4)          100毫升
          20%乳糖溶液                      5毫升
          2%伊红水溶液                      2毫升
          0.5%美兰水溶液      1.3-1.6毫升
    
    
    (2)制法:将普通肉汤琼脂加热熔化。冷至60°左右,将灭菌的上述三种溶液按量以无菌手续加入,摇匀,制成平板备用。
    (3)用途:供大肠杆菌及沙门氏菌检验用。
    注:
    ①大肠杆菌在伊红美兰琼脂平板上的菌落有时不典型,使用的平板表面应干燥,接菌培养24小时内观察为宜。
    ②市售干燥伊红美兰琼脂培养基,可按说明书使用。
    7.麦康凯(MacC)琼脂:
    (1)成份:
          蛋白胨                            20克
          乳糖                              10克
          氯化钠                              5克
          牛胆盐                              5克
          琼脂                        15-20克
          1%或0.5%中性红水溶液
                                    2.5或5毫升
          蒸馏水                      1000毫升
    
    
    (2)制法:
    除乳糖、胆盐、中性红水溶液外、将其它成份混合,微温溶解。用NaOH调PH为7.4-7.6。煮沸至琼脂熔化后过滤。加入胆盐、乳糖、中性红水溶液,摇匀分装。10磅30分钟灭菌。制成平板备用。注意避光保存。
    (3)用途:供分离大肠杆菌用。
    8.磷酸盐葡萄糖蛋白胨水培养基:
    成份:
        蛋白胨                                5克
        磷酸氢二钾(K2HPO4)              5克
        葡萄糖                                5克
        蒸馏水                          1000毫升
    
    
    制法:将上述成份加入蒸馏水中,微温使溶。调PH为7.2-7.4,煮沸过滤,分装试管,10磅30分钟灭菌。
    用途。供M-R和V-P试验用。
    9.蛋白胨水培养基:
    (1)成份:
          蛋白胨                            10克
          氯化钠                              5克
          蒸馏水                      1000毫升
    
    
    (2)制法:加热溶化上述成份。调PH为7.0-7.2煮沸过滤,分装,10磅30分钟灭菌。
    (3)用途:供靛基质试验用。
    10.枸橼酸铵(西蒙氏枸橼酸盐)琼脂:
    (1)成份:
    
          枸橼酸钠(无水)                    2克
          氯化钠                              5克
          硫酸镁(MgSO4·7H2O)    0.2克
          磷酸二氢铵(NH4H2PO4)         1克
          磷酸氢二钾(K2HPO4)            1克
          琼脂                        18-20克
          0.4%溴麝香草酚兰(B.T.B)液
                                          20毫升
          蒸馏水                      1000毫升
    
    
    (2)制法:除B.T.B和琼脂外,混合上述成份,微温使溶,调PH为7.0-7.2。加琼脂,煮沸使熔化,过滤,加入B.T.B液混匀。分装试管,10磅30分钟灭菌。置成斜面,备用。
    (3)用途:供枸橼酸盐利用试验用。
    注:
    ①所用琼脂应为不含游离糖,用前可用水浸泡或冲洗除糖。
    ②枸橼酸钠含2H2O,需加2.28克。
    11.糖类发酵培养基:
    (1)成份:
          蛋白胨                              1克
          氯化钠                          0.5克
          糖类                                1克
          0.5%酸性复红指示剂              1毫升
          (或0.4%BTB            0.6毫升)
          蒸馏水                          100毫升
          最终pH7.2-7.4
    
    
    (2)制法:
    称取蛋白胨和氯化钠加在蒸馏水中,微温使溶,调节pH至7.4,煮沸滤清后,按量加入不同糖类和酸性复红或BTB指示剂溶解混匀,分装至加倒管的灭菌小试管中,每管约3-4毫升,经8磅15分钟灭菌备用。用未经灭菌的小试管分装,则需10磅30分钟灭菌。
    (3)用途:
    供金黄色葡萄球菌和肠道杆菌属的生化鉴别试验用。凡能分解糖类发酵产酸者,培养基加酸性复红指示剂,可由粉红色变为红色;如加BTB指示剂,则由蓝绿色变为黄绿色。产酸并产气者,管内小玻璃倒管中有气泡。
    12.  5%乳糖发酵培养基:
    (1)成份:
          蛋白胨                          0.2克
          氯化钠                          0.3克
          磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)
                                          0.2克
          0.4%BTB指示剂          0.6毫升
          乳糖                                5克
          蒸馏水                        100毫升
    
    
    (2)制法:除乳糖和BTB指示剂外,其他成份加在蒸馏水中,微温使溶,调节pH至7.4,煮沸滤清,补足液量。加入乳糖及BTB溶液混匀后,分装在灭菌的并有倒管的小试管内,每管约2毫升,8磅15分钟灭菌,备用。
    (3)用途:凡迟发酵乳糖的细菌,接种后置37°培养24小时内,绝大部分可发酵产酸。
    13.SS琼脂培养基:
    (1)成份:
          蛋白胨                              5克
          牛肉膏                              5克
          琼脂                              20克
          乳糖                              10克
          胆盐                            8.5克
          枸橼酸钠(Na3C6H5O7·2H2O)
                                          8.5克
          硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)
                                          8.5克
          枸橼酸铁铵                          1克
          1%中性红水溶液                2.5毫升
          0.1%煌绿溶液(新配)      0.33毫升
          蒸馏水                        1000毫升
    
    
    (2)制法:
    先将蛋白胨、牛肉膏、琼脂、蒸馏水制成pH7.4的普通肉汤琼脂,10磅30分钟灭菌。趁热加入乳糖,摇匀。再依次加入其他成份,充分摇匀,使溶解,倒成平板备用。
    (3)用途:供分离鉴别肠道细菌用。
    注:
    ①制好的平板宜当日使用,一般不超过三天,否则效力可能减低。并应贮于冷暗处。
    ②胆盐用胆牛盐、三号胆盐(Bile  Salt  No.3)皆可。
    ③可用市售沙门氏志贺氏菌属琼脂干燥培养基,用法参见瓶签说明。
    14.三糖铁(TSI)琼脂培养基:
    (1)成份:
          蛋白胨                            15克}或蛋白
          蛋白胨                              5克}胨20克
          氯化钠                              5克
          乳糖                              10克
          蔗糖                              10克
          葡萄糖                              1克
          硫酸亚铁                        0.2克
          琼脂                        12-15克
          0.2%酚红溶液              12.5毫升
          硫代硫酸钠                      0.2克
          蒸馏水                        1000毫升
    (2)制法:除糖、指示剂、硫酸亚铁和硫代硫酸钠外(硫酸亚铁、硫代硫酸钠先用少量水溶解),其它成份加在蒸馏水中,微温使溶,调pH为7.4。过滤,加入其余成份,分装试管。10磅30分钟灭菌,趁热置成短斜面高层,凝后备用。应避光置冷暗处保存。
    (3)用途:供肠道细菌初步鉴别用。
    注:亦可用双糖铁琼脂培养基。
    15.氨基酸脱羧酶测定培养基:
    (1)成份:
          蛋白胨                              5克
          牛肉膏                              5克
          D-葡萄糖                      0.5克
          维生素B6醛(吡哆醛Pyridoxal)
                                              5毫升
          溴甲酚紫(1.6%)        0.625毫升
          甲酚红(0.2%)              2.5毫升
          蒸馏水                        1000毫升
    
    
    (2)制法:
    将以上成份加热溶解,调pH为6.0,再加指示剂。将上述基础培养基分出100毫升作空白对照。再加L-赖氨酸,使浓度达到1%。如用DL型氨基酸,浓度达到2%。再调pH为6.0。摇匀,分装小试管,每管3-4毫升,10磅30分钟灭菌。
    (3)用途:
    供肠杆菌科的细菌鉴定用。指示剂呈紫色或紫红色为阳性反应,呈黄色为阴性反应。对照管应呈黄色。
    16.氰化钾培养基:
    (1)成份:
          蛋白胨                              3克
          氯化钠                              5克
          磷酸二氢钾                  0.225克
          磷酸氢二钠(Na2HPO4·2H2O)
                                        5.46克
          蒸馏水                      1000毫升
    
    
    (2)制法:
    将以上成份溶解后调pH至7.6,10磅30分钟灭菌。冷却后,加15毫升0.5%的氰化钾液,无菌分装至灭菌的小试管中,每管1毫升。在4°可保存二周。同时做一份不加氰化钾的空白对照培养基。
    (3)用途:
    供肠杆菌科各属鉴别用。能在氰化钾培养基中生长者,为阳性反应。不生长者为阴性反应,但空白对照培养基上应生长。
    注:
    ①氰化钾为剧毒药,操作时应特别小心。
    ②培养基用后,每管加入几粒硫酸亚铁和0.5毫升20%氢氧化钾以去毒,然后灭菌洗刷。
    17.十六烷三甲基溴化铵琼脂培养基:
    (1)成份:
          牛肉膏                              3克
          蛋白胨                            10克
          氯化钠                              5克
          十六烷三甲基溴化铵(Cetrimide)
                                          0.3克
          琼脂                        15-20克
          蒸馏水                      1000毫升
    
    
    (2)制法:除琼脂外,将上述成分混合加热溶解,调节pH至7.4-7.6加入琼脂。10磅20分钟灭菌后,冷至50°左右倾注平皿,制成平板备用。
    (3)用途:供分离绿脓杆菌用。
    18.明胶十六浣三甲基溴化铵琼脂培养基:
    (1)成份:
          蛋白胨                            20克
          氯化镁(无水)                  1.4克
          硫酸钾(无水)                    10克
          明胶                              75克
          琼脂                        18-20克
          十六烷三甲基溴化铵              0.3克
          甘油(化学纯)                  10毫升
          蒸馏水                        100毫升
    (2)制法:
    取蛋白胨、氯化镁和硫酸钾,加在蒸馏水中微温使溶。调节pH至7.6,加热煮沸过滤,补足液量。趁热加入甘油和十六烷三甲基溴化铵,振摇溶解混匀。加入明胶后浸泡15分钟,加热熔解混匀。最后加琼脂,在水浴中加热煮沸熔化,振摇混匀,分装。经10磅30分钟灭菌后,
冷至50°左右倾注平皿,凝固备用。
    (3)用途:
    供检验绿脓杆菌分离培养用,可直接观察能否产生绿脓菌素及液化明胶。划线后,须正置放在培养箱内培养,以免明胶被菌液化后流溢皿内。
    19.绿脓菌素测定用培养基(PDP琼脂):
    (1)成份:
          蛋白胨                            20克
          氯化镁(无水)                  1.4克
          硫酸钾(无水)                    10克
          琼脂                        18-20克
          甘油(化学纯)                  10毫升
          蒸馏水                      1000毫升
    
    
    (2)制法:
    称取蛋白胨、氯化镁和硫酸钾,加在蒸馏水中微温使溶。调节pH至7.6,煮沸过滤补足液量。趁热加入甘油振摇混匀,加入琼脂煮沸熔化后,分装至试管内,每管约6毫升。15磅20分钟灭菌后,置成斜面,凝固备用。
    (3)用途:
    供测定绿脓菌素用。
    20.硝酸盐胨水培养基:
    (1)成份:
          蛋白胨                            10克
          酵母膏                              3克
          硝酸钾                              2克
          亚硝酸钠                        0.5克
          蒸馏水                      1000毫升
    
    
    (2)制法:
    称取蛋白胨和酵母膏,加在蒸馏水中微温使溶。用NaOH液调节pH7.2-4.7,煮沸滤清后补足液量,趁热加入硝酸钾和亚硝酸钠溶解混匀。分装在加有倒管的试管内,每管6-8毫升,10磅30分钟灭菌后备用。
    (3)用途:
    供检验绿脓杆菌时测定硝酸盐还原分解产气试验用。
    21.明胶培养基:
    (1)成份:
          牛肉膏                              3克
          蛋白胨                              5克
          明  胶                          120克
          蒸馏水                      1000毫升
    
    
    (2)制法:
    称取各成份加在蒸馏水中,浸泡约20分钟,随时搅拌,加热使熔。调节pH至7.4,分装在试管内约3-5毫升,10磅30分钟灭菌后,直立放置,凝后备用。
    (3)用途:供测定细菌能否使明胶液化试验用。
    22.亚碲酸钠肉汤培养基:
    (1)成份:
          蛋白胨                            10克
          氯化钠                              5克
          牛肉膏                              3克
          蒸馏水                      1000毫升
          1%亚碲酸钠液                    3毫升
    
    
    (2)制法:
    称取蛋白胨、氯化钠和牛肉膏加在蒸馏水中,微温使溶,调节pH7.6-7.8,加热煮沸滤清后补足液量,定量分装在三角瓶内,每瓶100毫升,10磅30分钟灭菌后备用。
    另外精确称取0.1克亚碲酸钠,加在10毫升灭菌蒸馏水内,溶后即为1%的亚碲酸钠液。临用前将其加在上述肉汤培养基中,每100毫升加0.3毫升,混匀即得。
    
    
    注:此液须临时配制,不可久存。
    (3)用途:
    供金黄色葡萄球菌增菌培养用。
    23.亚碲酸钠北沙参胨水培养基:
    (1)成份:
          蛋白胨                            15克
          酵母浸膏                            5克
          氯化钠                              5克
          磷酸氢二钾                          5克
          10%北沙参浸液              150毫升
          蒸馏水                        850毫升
          最终pH7.4-7.6
    
    
    (2)制法:
    北沙参浸液的制备:取北沙参100克,用水洗净浸泡在1000毫升蒸馏水中,置冰箱过夜泡软。次日取出将沙参切割成片,仍置原蒸馏水中继续浸泡2小时。然后加热煮沸30分钟,用四层纺布滤浸液,并将药渣用蒸馏水浸洗1-2次合并在浸液中,补足原液使成1000毫升即
为10%的北沙参浸液,分装,10磅30分钟灭菌备用。第一次开瓶用过之后,可在浸液内加入1%的氯仿作防腐剂,盖好瓶塞充分振摇,第二天再振摇数次即可长期保存在冰箱内备用,不必再高压灭菌。
    称取各成份加在蒸馏水中,微温使溶,调节pH为7.6-7.8,加热煮沸用滤纸过滤,补足液量,混匀分装在三角瓶内,每瓶100毫升,10磅30分钟灭菌备用。
    
    
    亚碲酸钠北沙参胨水培养基的制备:
    在上述每100毫升北沙参胨水中,加新配制的1%亚碲酸钠液0.3毫升,混匀即得。
    (3)用途:供金黄色葡萄球菌增菌用。
    24.卵黄高盐琼脂培养基:
    (1)成份:
          蛋白胨                              6克
          氯化钠                            30克
          牛肉膏                          1.8克
          琼脂(用量3%)                  23克
          蒸馏水                        650毫升
          10%氯化钠卵黄液            100毫升
    
    
    (2)制法:
    取新鲜鸡蛋一个,将壳用碘酒及酒精棉球充分擦拭消毒后,用无菌镊子在鸡蛋两端各打开一个小孔,将蛋清弃掉,以无菌手续取出卵黄,放在装有玻璃珠的100毫升10%氯化钠灭菌水溶液的三角瓶中,充分摇匀,制成卵黄高盐水悬液备用。
    称取蛋白胨、牛肉膏和氯化钠加在蒸馏水中,微温使溶后,用NaOH调节pH为7.6-7.8,煮沸过滤。再按量加入3%的琼脂煮沸,使熔,过滤,分装。15磅20分钟灭菌,待冷至60°时,将上述卵黄高盐水悬液加在其中,充分摇匀后倾注平皿,凝后备用。
    (3)用途:
    供分离培养金黄色葡萄球菌用。
    25.血琼脂培养基:
    (1)成份:
          肉汤琼脂                      100毫升
          无菌脱纤维兔血(或羊血)
                                      5-10毫升
    
    
    (2)制法:将肉汤琼脂培养基加热熔化,待冷至50°左右,以无菌手续吸取无菌脱纤维兔血加入摇匀,制成平板。置冰箱内,备用。
    (3)用途:供分离金黄色葡萄球菌及破伤风杆菌用。
    无菌脱纤维血制备法:脱纤维血可从家兔心脏抽取,取血时应严格消毒皮毛防止污染。取出的血液应立即注入装有玻璃珠的灭菌烧瓶内,充分摇动脱除血纤维后,置冰箱内保存备用。
    26.TMP北沙参高盐琼脂培养基:
    (1)成份:
          蛋白胨                            20克
          酵母浸膏                            5克
          氯化钠                            40克
          磷酸氢二钾                          5克
          10%北沙参浸液              150毫升
          蒸馏水                        850毫升
          琼脂                        18-20克
          甘露醇                              5克
          1%酚红水溶液                2.5毫升
          1%亚碲酸钾(钠)液            15毫升
          最终pH7.4-7.6
    
    
    (2)制法:
    10%的北沙参浸液,可按亚碲酸钠北沙参胨水培养基项下的方法制备。除甘露醇、酚红、琼脂和亚碲酸钾(钠)之外,称取其它成份加在蒸馏水中,微温使溶并混匀后,调节pH7.6-7.8。加入琼脂煮沸熔化。过滤除去沉淀,按量加入甘露醇和酚红溶解混匀。定量分装,10
磅30分钟灭菌后备用。
    临用前精确称取0.1克亚碲酸钾,加在10毫升灭菌蒸馏水中,溶后即为1%亚碲酸钾液,取上项灭菌熔化后的北沙参琼脂,每100毫升加入亚碲酸钾液各1.5毫升,混匀后倾注平皿。亚碲酸钾须临用配制,加量要准确。制成平板须在冰箱内保存,三日内用完,否则效果下降。

    (3)用途:
    供金黄色葡萄球菌分离培养用。
    27.TMP琼脂培养基:
    TMP北沙参高盐琼脂培养基如不加10%北沙参浸液即为TMP琼脂培养基。
    28.尿素培养基:
    (1)成份:
          蛋白胨                              1克
          氯化钠                              5克
          磷酸二氢钾                          2克
          葡萄糖                              1克
          尿素                                2克
          (或20%的无菌尿素溶液      10毫升)
          琼脂                              15克
          0.2%酚红溶液                  6毫升
          蒸馏水                      1000毫升
    
    
    (2)制法:
    一法:除酚红、尿素、葡萄糖和琼脂外,用水微温溶解以上成份,调节pH至7.2,加入琼脂,煮沸熔化,再加入尿素、葡萄糖和酚红,摇匀。
    分装于灭菌试管内,8磅10分钟灭菌,置成斜面备用。
    二法:除尿素、葡萄糖、琼脂和酚红外,其他成份混于水中,微温使溶,调pH至7.0-7.2,加入琼脂,煮沸熔化过滤,加入葡萄糖和酚红摇匀,分装于三角瓶,10磅20分钟灭菌。待冷至50-55°,以无菌手续按比例加入无菌的20%尿素溶液,摇匀,再分装灭菌小试
管中,置成斜面即可。
    (3)用途:供鉴别沙门氏菌属与变形杆菌属用。
    注:
    ①尿素不稳定,制定培养基时,应严格控制灭菌温度和时间。
    ②接种细菌时,要挑取大量细菌,浓厚涂布于整个斜面。
    ③20%无菌尿素液的配制,详见试剂的配制。
    29.半固体培养基:
    (1)成份:
          蛋白胨                            10克
          氯化钠                              5克
          牛肉膏                              3克
          琼脂                            4-6克
          蒸馏水                      1000毫升
    (2)制法:除琼脂外,混合上述成份,微温使溶,调pH至7.6,加入琼脂,煮沸熔化,过滤,分装小试管,15磅20分钟灭菌后,直立放置,凝后备用。
    (3)用途:供动力检查和保存菌种用。
    30.庖肉培养基:
    (1)牛肉碎块的制备:取新鲜牛肉,除去脂肪及筋腱,加水煮沸约10分钟,切成约5见方毫米的小块,称重,按1∶3(肉∶水)加蒸馏水,置4-10°浸泡18-20小时后,煮沸1小时,用白布过滤(滤液即为1∶3牛肉浸液),肉渣以自来水漂洗2次,然后加入适量氢氧
化钠,搅匀,使pH在8.4左右,浸泡过夜,次日倾去上层水,用蒸馏水冲洗2-3次,放在纱布上,自动沥干无滴水(不要挤压)。将肉渣铺在搪瓷盘上,15磅20分钟灭菌,于80-100°烘干,筛去碎屑,装瓶保持干燥,备用。
    (3)用途:供破伤风杆菌增菌用。
    31.0.1%葡萄糖庖肉培养基:
    制备方法与庖肉培养基相同。另在肉汤培养基内加入0.1%葡萄糖即可。再加庖肉,用10磅30分钟灭菌,pH应为7.2-7.6。
    用途:供破伤风杆菌增毒用。
    32.1%葡萄糖血琼脂:
    取肉汤琼脂加入1%葡萄糖,10磅30分钟灭菌后(pH应为7.2-7.6),冷至约50°时,以无菌手续加入5-10%的脱纤维兔血或羊血混匀,倾注平皿,凝后,烘干凝固水备用。
    用途:供分离破伤风杆菌用。
    33.庖肉琼脂培养基:
    取庖肉培养基,加0.1-0.3%琼脂,熔化灭菌后即得。
    用途:供破伤风杆菌保存菌种用。
    34.新霉素葡萄糖血琼脂
    (1)成份:
          蛋白胨                            10克
          氯化钠                              5克
          葡萄糖                            10克
          新霉素                          0.1克
          牛肉浸液(1∶3)          1000毫升
    
    
    (2)制法:除葡萄糖、新霉素外、混合上述其它成份,加热使溶解后,加入葡萄糖、新霉素,10磅30分钟灭菌(pH应为7.2-7.4)。冷至45-50°时,以无菌手续加入6-8%的脱纤维兔血(或羊血),摇匀,倾注平皿,制成血平板,用前烘干表面冷凝水,便于分
离。
    (3)用途:供分离破伤风杆菌用。
    五、血浆的制备
    1.称取0.5克枸橼酸钠加在10毫升生理盐水内,分装试管,15磅20分钟灭菌后即为5%枸橼酸钠生理盐水,供采血时做抗凝剂用。
    2.将采血用的注射器、针头和镊子,以及带棉塞的空试管,离心沉淀管等15磅20分钟灭菌后,烘干备用。
    3.用家兔血或羊血、人血制备皆可。从家兔心脏采血时,先将其固定在解剖架上,剪去左胸部心脏跳动处的兔毛,并以碘酒棉球充分擦拭消毒后,再用酒精棉球擦去碘酒。然后将灭菌注射器装好针头,以无菌手续吸取枸橼酸钠抗凝剂约1毫升,穿刺家兔左胸部的肋间抽取心脏血液约
9毫升轻轻混合均匀。待血液不再凝固时,徐徐放入灭菌离心沉淀管中,置离心机上每分钟1500转离心沉淀10分钟。用灭菌吸管将离心管中的无色血浆,轻轻吸至带棉塞的灭菌试管里,置冰箱内保存备用。
    4.制备好的家兔血浆,用已知血浆凝固酶试验阳性的金黄色葡萄球菌菌株,按凝固酶试验法进行测定。经试验为阳性反应,证明血浆合格,方可用于常规检验。
    六、细菌实验室注意事项
    1.实验室应经常保持清洁,严禁吸烟和饮食,以免感染。
    2.工作人员入室时必须穿戴工作衣、帽。离室时脱去工作衣帽。挂于指定地方,并经常洗涤保持清洁。
    3.实验室桌面应经常保持整洁,用3%来苏儿溶液擦拭消毒桌面。
    4.工作人员操作前后或离开实验室,必须用2%来苏儿溶液洗手消毒。
    5.无菌室应有专用的物品(无菌衣、帽、口罩、胶鞋、脸盆、盆架、毛巾、接种棒、火柴、酒精灯、橡皮乳头、盛有5%来苏儿的吸管等)。无菌衣、帽等,应经常高压消毒。
    6.无菌室定期用5%石炭酸蒸气消毒。定期检查无菌室杂菌数(在室内打开15分钟的肉汤琼脂平板经37°培养48小时左右),3个平板平均杂菌数要求在5个以下,如超过应彻底消毒。
    7.无菌室操作前先开紫外灯照射15-20分钟,操作完应及时清洁无菌室,再用紫外灯照射20分钟。
    8.废弃培养物应放入消毒桶内,用15磅30分钟灭菌后洗刷。无菌的实验用品应浸泡在5%来苏儿溶液内,24小时后取出冲洗。
    9.接种环或接种针每次使用前后,必须通过火焰烧红灭菌,待冷却后,方可接种培养物。
    10.必须用带橡皮乳头的吸管吸取菌液,切勿直接用口接触吸管。
    11.如有菌液撒在桌上或地上,应立即用5%石炭酸或来苏儿倒在被污染处至少30分钟以上,再作处理。
    12.凡带有活菌的物品,必须经消毒后才能在水笼头下冲洗,严禁污染下水道。
  

1984年10月31日
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