（2）核酸的分子杂交
前面已经谈到，亲缘关系相近的微生物，其DNA碱基比相同或相近。反之则不然，也就是说，DNA碱基比相同或相近的微生物，其亲缘关系并不一定相近。这是因为DNA碱基比的相同或相近并不反映碱基对的排列顺序相同或相近，而微生物间的亲缘关系主要取决于它们碱基对的排列顺序的相同程度。因此，要确定它们之间的亲缘关系就要进行核酸的分子杂交试验，以比较它们之间碱基对序列的相同程度。核酸的分子杂交试验在微生物分类鉴定中的应用主要包括DNA—DNA分子杂交和DNA—rRNA分子杂交等方法。
①DNA—DNA分子杂交：该方法的基本原理是利用DNA双链解离成单链（变性 ），单链结合成双链（复性），碱基配对的专一性，将不同来源的DNA在体外解链，并在合适的条件下使单链中的互补碱基配对结合成双链DNA。然后根据能生成双链的情况，测定杂合百分比。如果两条单链DNA的碱基序列完全相同，则它们能生成完整的双链，即杂合率100%；如果两条链的碱基序列只是部分相同，则它们生成的“双链 ”含有部分单链，其杂合率小于100%。因此，杂合率越高，表示两个DNA之间碱基序列的相似性越高，说明它们之间的亲缘关系也就越近。许多资料表明，DNA—DNA杂交最适合于微生物种一级水平的研究。根据约翰逊1981年的试验指出，DNA—DNA杂交同源性在60%以上的菌株可视为同一个种，同源性低于20%者为不同属的关系，同源性在20—30%之间可视为属内紧密相关的种。
核酸的分子杂交的具体测定方法很多。按杂交反应的环境可分为液相杂交和固相杂交两大类，前者在溶液中进行，后者在固体支持物上进行。在这些方法中，有的需要用同位素标记的DNA，有的则用非同位素标记。在细菌分类中，常用固相杂交法进行测定。这种方法的大致做法是：将未标记的各微生物菌株的单链DNA预先固定在硝酸纤维素微孔滤膜（或琼脂等）上，再用经同位素标记的参考菌株的单链DNA小分子片段在最适复性温度条件下与膜上的DNA单链杂交；杂交完毕后，洗去滤膜上未配对结合的带标记的DNA片段；然后测定各菌株DNA滤膜的放射性强度。以参考菌株自身复性结合的放射性计数值为百分之百，即可计算 出其他菌株与参考菌株杂交的相对百分数。这些百分数值即分别代表这些菌株与参考菌株的同源性或相似性水平，并以此数值来判断各菌种间的亲缘关系。
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