③核苷酸序列分析从本章第一节可以看出，16SRNA大分子在生物进化研究中起着重要的作用。伍斯就是根据对60株细菌的16SRNA的核苷酸序列分析研究后，提出了生命的第三种形式———古细菌。16SrRNA序列同源性的应用不仅发现了古细菌，同时还揭示了细菌域各群间的系统发育关系，修正了许多细菌的分类地位，提出了不同于传统细菌分类体系的新的分类系统。新的分类系统体现了微生物分类的研究从表观特征向系统发育体系的发展。新的细菌分类系统与传统的细菌分类体系相比，也存在较多的差异，这主要表现在：
a、 改变了细胞壁结构作为亲缘关系划分的标志之一，如无细胞壁的支原体，实际是革兰氏阳性的芽孢梭菌的一个后代分支。
b、改变了营养类型作为种系发生的特征，如光合细菌并非是独立于非光合种群的进化分支，而是每种光合种群都代表了一个高阶的分类单元，其后代分支包括非光合细菌。
c、尽管革兰氏阳性细菌是系统发育关系密切的一群细菌，但革兰氏阴性菌却包括了10个亚群。
应用16SrRNA核苷酸序列分析法进行微生物分类鉴定，首先要将微生物进行培养，然后提取并纯化16SrRNA，进行16SRNA序列测定，获得各相关微生物的序列资料，再输入计算机进行分析比较，由计算机分析微生物之间系统发育关系并确定其地位。
16SrRNA核苷酸序列测定和分析方法可分两类：16SrRNA寡核苷酸编目分析法和16SrRNA全序列分析法。
16SrRNA寡核苷酸编目分析法的大致做法如下：从培养的微生物中提取并纯化16SrRNA，再将纯化的16SrRNA用核糖核酸酶（如T1核酸酶）处理，水解成片段，并用同位素体外标记（也可以在培养微生物时进行活体标记），然后用双向电泳层析法，分离这些片段，用放射自显影技术确定不同长度的寡核苷酸斑点在电泳图谱中的位置，根据寡核苷酸在图谱中的位置，小片段的寡核苷酸分子序列即可确定。对于不能确定序列的较大片段核苷酸，还需要把斑点切下，再用不同核糖核酸酶或碱水解，进行二级分析，有的可能还要进行三级分析，直至弄清所有片段的序列为止。在此基础上，对6个或更多核苷酸的片段按不同长度进行编目。将所有要比较的微生物的序列目录编好后，即可对这些序列目录资料进行分析比较，采用相似性系数法比较各微生物之间的亲缘关系。相似性系数法是通过计算相似性系数SAB值来确定微生物之间的关系。
如果SAB等于1，说明所比较的两菌株rRNA序列相同，两菌株亲缘关系相近，若SAB值小于0.1，则表明亲缘关系很远。
寡核苷酸编目分析法只获得了16SrRNA分子的大约30%的序列资料，加上采用的是一种简单相似性的计算方法，所以其结果有可能出现误差，应用上受到一定限制。随着核酸序列分析技术的发展，20世纪80年代末又陆续发展了一些rRNA全序列分析方法，其中最常用的是直接序列分析法。这种方法用反转录酶和双脱氧序列分析，可以对未经纯化的rRNA抽提物进行直接的序列测定。
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