游泳池水中大肠菌群检验方法

   
   一、大肠菌群多管发酵法测定
1定义
大肠菌群（coliform bacteria）系指一群在36±1℃培养24h能发酵乳糖、产酸产气的需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。
2 仪器
见《公共场茶具的大肠菌群测定方法》。
3培养基和试剂
3.1乳糖蛋白胨培养液
3.1.1成分：蛋白胨 10g
牛肉膏 2g
乳糖 5g
氯化钠 5g
1.6%（V/V）溴甲酚紫乙醇溶液 1mL
蒸馏水 1000mL
三倍浓缩乳糖蛋白胨培养液按上述乳糖蛋白胨培养液浓缩三倍配制。
3.1.2配法：将蛋白胨、牛肉膏、乳糖及氯化钠置于1000ml蒸馏水中加热溶解，调pH到]7.2～7.4。再加入1ml 1.6%溴甲酚指示剂，充分混匀，分装到含有倒管的试管中，115℃高压灭菌15min。
3.2伊红美兰琼脂
见《公共场所茶具的大肠菌群测定方法》。
3.3革兰氏染色液
风《公共场所茶具的大肠菌群测定方法》。
3.4染色法
见《公共场所茶具的大肠菌群测定方法》。
4推测性试验
4.1在2个装有50ml三倍浓缩乳糖胆盐培养液的大试管或烧杯内各加入水样100ml。
4.2在10支装有5ml三倍浓缩乳糖胆盐培养液的试管里各加入水样10ml。
4.3轻摇试管，使液体充分混匀，置36±1℃培养箱中，培养24h。
4.4观察每管是否产气，如不产气则报告为大肠菌群阴性；若有气体产生则为推测性试验阳性，需做进一步的证实试验。
5证实试验
5.1平板分离
自推测性检验阳性管中取一接种环培养液，接种到伊红美蓝琼脂平板上，置36±1℃培养箱培养18～24h，观察菌落形态，典型的大肠菌群菌落为黑紫色或红紫色，具有金属光泽。
5.2复发酵试验
挑取可疑大肠菌群菌落1或2个进行革兰氏染色，同时接种乳糖发酵管，于36±1℃培养箱中，培养24h。
5.3凡乳糖发酵管最终产酸产气，革兰氏染色为阴性的最大可能数（MPN）检索表得出1000ml水样中总大肠菌群的MPN值。
　
　
　
总大肠菌群（MPN）检索表
100mL水量的阳性管数
 100mL水量的阳性管（瓶）数 
0 1 2 
每L水样中总大肠菌群 每L水样中总大肠菌群数 每L水样中总大肠菌群数 
二、大肠菌群滤膜法测定
1 定义        
大肠菌群（coliform bacteria）为需氧及兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌，将带菌滤膜贴在含乳糖的选择性培养基上，经37℃培养24小时后，呈现深暗红色带金属光泽的菌落。
2仪器
2.1滤器
2.2滤膜:乳径0.45m m。直径根据滤器规格，目前常用的有35mm和27mm两种。
2.3抽滤设备
2.4无齿镊子
2.5其它仪器见《公共场所茶具的大肠菌群检验方法》
3培养基
3.1品红亚硫酸钠培养基
3.1.1成分：蛋白胨 10g
酵母浸膏 5g
牛肉膏 5g
乳糖 10g
琼脂 10～20g
磷酸氢二钾 3.5g
无水亚硫酸钠 5g
5%碱性品红乙醇溶液 20mL
蒸馏水 1000mL
3.1.2储备培养基的制备
将磷酸氢二钾、酵母浸膏、牛肉膏及蛋白胨加到含有900ml蒸馏水的烧杯中，溶解后调pH值到7.2～7.4，加入琼脂加热溶解，用蒸馏水补足至1000ml，趁热用脱脂棉或绒布过滤，再加入乳糖，混匀后定量分装于烧瓶内， 115℃高压灭菌20min，置冷暗处备用。
3.1.3平皿培养基的制备
将上述培养基加热融化，根据培养基的用量，碱性品戏乙醇溶液与培养基按1：50的比例，用灭菌吸管吸取一定量的碱性品红溶液置于灭菌空试管中。再按1：200的比例称取所需的无水亚硫酸钠置于另一个来菌空试管内，加灭菌水少许使其溶解，在沸水浴中煮沸灭菌10min。
用灭菌吸管吸取已灭菌的亚硫酸钠溶液，滴加于碱性品红乙醇溶液至深红色退成淡粉红色为止。将此亚硫酸钠与碱性品红的混合液全部加入已融化的储备培养基中，并充分混匀（防止产生气泡），立即将此种培养基适量倾入灭菌的空平皿内， 待其冷却凝固后置冰箱内备用。此培养基于冰箱中保存不宜超过两周，如培养基已由淡红色变成深红色，则不能再用。
3.2乳糖蛋白胨培养液
见《游泳池水中大肠菌群多管发酵测定法》
4操作步骤
4.1滤膜灭菌：将滤膜放入含蒸馏水的烧杯中，煮沸灭菌三次，每次15min。前两次煮混后需更换水洗涤2～3次，以除去留溶剂。
4.2滤器灭菌：用121℃高压灭菌20min或用点燃的酒精棉球火焰灭菌。
4.3水样过滤：用无菌镊子夹灭菌滤膜边缘部分，将滤膜粗糙面向上，贴放在滤床上。固定好滤器，将100ml水注入滤器中,打开滤器阀门。在-0.5大气压下抽滤。
4.4培养：水样滤室外后，再抽气约5s，关上滤器阀门，取下滤器。用灭菌镊子夹滤膜边缘部分，移放在乳糖琼脂分离培养基上，滤膜截留细菌面向上，滤膜应与培养基完全贴紧，两者之间不得留有气泡。然后将平皿倒置，放入36±1℃恒温箱内培养18～24h。
4.5挑取滤膜上符合下列特征的菌落进行革兰氏染色，镜检。
紫红色，具有金属光泽的菌落；
深红色，不带或略带金属光泽的菌落；
淡红色，中心色较深的菌落。
4.6将革兰氏染色为阴性的无芽胞杆菌接种到乳糖蛋白胨培养液中，于36±1℃培养48h。产酸产气者证实为大肠菌群阳性。
5检验结果报告
计算滤膜上生长的证实为大肠菌群的菌落数，再乘以10即为每1000ml水样中的大肠菌群数。

 

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