化妆品微生物标准检验方法细菌总数测定及注解

   
   化妆品微生物标准检验方法细菌总数测定及注解
中华人民共和国国家标准
化妆品微生物标准检验方法细菌总数测定 UDC 668：576 .85.07
(GB7918.2－87)
Standard methods of microbiological examination for cosmetics 
Standard plate count
细菌总数系指1g或1ml化妆品中所含的活菌，数量。测定细菌总数可用来判明化妆品被细菌污染的程度，以及生产单位所用的原料、工具设备、工艺流程、操作者的卫生状况，是对化妆品进行卫生学评价的综合依据。
本标准采用标准平板计数法。
1 方法提要
化妆品中污染的细菌种类不同，每种细菌都有它一定的生理物质性，培养时对营养要求，培养温度、培养时间、pH值、需氧性质等均有所不同。在实际工作中，不可能做到满足所有菌的要求，因此所测定的结果，只包括在本方法所使用的条件下（在卵磷脂、吐温80营养琼脂上，于37℃培养48h)生长的一群嗜中温的需氯及兼性厌氧的细菌总数。
2 培养基和试剂
2.1 生理盐水：见GB 7918-87《化妆品微生物标准检验方法 总则》。
2.2 卵磷脂、吐温80-营养琼脂培养基
成分： 蛋白胨                20g
牛肉膏                             3g
氯化钠                            5g
琼脂                             15g
卵磷脂                           1g
吐温80                           7g
蒸馏水                    1000ml
制法：先将卵磷脂加到少量蒸馏水中，加热溶解，加入吐温80将其他成分(除琼脂外)加到其余蒸馏水中，溶解。加入已溶解的卵磷脂、吐温80，混匀，调pH值为7.1～7.2，加入琼脂，121℃(15 1b)20min高压灭菌，储存于冷暗处备用。
3 仪器
3.1 锥形烧瓶。
3.2 量筒。
3.3 pH计或精密pH试纸。
3.4 高压消毒锅。
3.5 试管。
3.6 灭菌平皿：直径9cm。
3.7 灭菌刻度吸管：10ml、2ml、1ml。
3.8 酒精灯。
3.9 恒温培养箱。
3.10 放大镜。
4 操作步骤
4.1 用灭菌吸管吸取1:10稀释的检样2ml，分别注入到两个灭菌平甲内，每皿1ml。另取1ml注入到9ml灭菌生理盐水试管中(注意勿使吸管接触液面)，更换一支吸管，并充分混匀，使成1:100稀释液。吸取2ml,分别注入到两个灭菌平皿内，每皿1ml。如样品含菌量高，还可再稀释成1:1000，1:10000，······等，每种稀释度应换1支吸管。
4.2 将熔化并冷至45～50℃的卵磷脂、吐温80、营养琼脂培养基倾注平皿内，每皿约15ml，另倾注一个不加样品的灭菌空平皿，作空白对照。随即转动平皿，使样品与培养基充分混合均匀，待不琼脂凝固后，翻转平皿，置37℃培养箱内培养48h。
5 菌落计数方法
先用肉眼观察，点数菌落数，然后再用放大5～10倍的放大镜检查，以防遗漏。记下各平皿的菌落数后。求出同一稀释度各平皿生长的平均菌落数。若平皿中有连成片状的菌落或花点样菌落蔓延生长时，该平皿不宜计数。若片状菌落不到平皿中的一半，面其余一半中菌落数分布又很均匀，则可将此半个平皿菌落计数后乘2，以代表全皿菌落数。
6 菌落计数及报告方法
6.1 首先选取平均菌落数在30～300之间的平皿，作为菌落总数测定的范围。当只有一个稀释度的平均菌落数符合此范围时，即以该平皿菌落数乘其稀释倍数（见表中例１）。
6.2 若有两个稀释度，其平均菌落数均在30～300个之间，则应求出两者菌落总数之比值来决定。若其比值小于或等于2应报告其平均数，若大于2则报告其中较小的菌落数(见表中例2及例3)。
6.3 若所有稀释度的平均菌落数均大于300个，则应按稀释度最高的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表中例4)。
6.4 若所有稀释度的平均菌落数均少于30个，则应按稀释度最低的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表中例5)。
6.5 若所有稀释度的平均菌落数均不在30～300个之间，其中一个稀释度大于300个，而相邻的另一稀释度小于30个时，则以接近30或300的平均菌落数乘以稀释倍数报告之(见表中例6)。
6.6 若所有的稀释度均无菌生长，报告数为每克或每毫升小于10个。
6.7 菌落计数的报告，菌落数在10以内时，按实有数值报告之，大于100时，采用二位有效数字，在二位有效数字后面的数值，应以四舍五入法计算。为了缩短数字后面零的个数，可用10的指数来表示(见下表报告方式栏)。在报告菌落数为“不可计”时，应注明样品的稀释度。
细菌计数结果及报告方法
 　
附加说明：
本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所归口。
本标准由“化妆品微生物标准检验方法”起草小组起草。
本标准主要起草人周淑玉。
本标准由中国预防医学科学院环境卫生监测所负责解释
注解:
（1）操作注意事项
1）尽量使菌细胞分散开，使每个菌细胞生成一个菌落，否则将会导致重大的技术误差。
2）制成供试液后，应尽快稀释，注皿。一般稀释后应在1小时内操作完毕。
3）注意抑菌现象。由于防腐剂未被中和，往往使平板计数结果受影响，如低稀释时菌落少。而高释释度时菌落数反而增大。
4) 对照试验。化妆品的稀释液（特别是1:1O的稀释液）常带有化妆品颗粒，有时与菌落很难区分，为了避免与细菌菌落发生混淆，可作一个检样稀释液与琼脂混合的平板，不经培养放到4℃环境中，以便计数检样菌落时用作对照。
另一种防止化妆品颗粒与菌落混淆的方法是培养基中加TTC
（2）细菌总数其他测定法
1) 改良的细菌总数测定法一TTC法
化妆品一般由多种物质混合而成，在进行细菌测定前虽然经过处理，但有时还会存在极难溶解的颗粒,特别是粉类化妆品和某些膏霜类化妆品。化妆品在前处理时有气泡产生，颗粒和气泡容易与细菌菌落相混，影响计数的准确性。
方法：在已熔化的卵磷脂吐-80营养琼脂中，按100ml加入1m1 0.5％的氯化三苯四氮唑（2,3,5 triphenyi terazoloride ，TTC）水溶液之量加入，操作方法同标准法。培养后如系化妆品的颗粒，不见变化，如为细菌，则生成红色菌落。配好的含TTC培养基，应先用未加TTC的对照，以观察其计数是否有不利影响（TTC在一定浓度下对革兰氏阳性菌有抑制作用）。
TTC溶液要放冷暗处保存，以防受热与光照而发生分解。TTC溶液在使用前应在水浴中煮沸半小时。
原理：无色的TTC是作为受氢体加入培养基中，如果有细菌存在，培养后在细菌脱氢酶的作用下，TTC便接受氢而成为红色的三苯基甲*（*表示月、牙、牙和日组成的字，因无此字）（fomazan），使菌落呈现红色，其反应式见结构图：
2）平板表面涂布法
将培养基制成平板，经干燥后，于其上滴加检样稀释液0.2ml，用“L’形玻璃棒涂布于整个平板的表面，放置片刻（约10分钟）将平板翻转，放入37℃温箱内培养48小时，取出进行菌落计数，然后乘以5，即为1ml稀释样中的菌落数，再乘以稀释倍数，即得每克（或每毫升）检样所含菌落数。
此法的优点：菌落生长在表面，便于识别和检查其形态，与检样中的颗粒易区别；细菌不必遭受融化琼脂的热力，不致因此而使细菌细胞受到损伤而不生长。
此法缺点：取样量较倾注法少，代表性将受到一定的影响；本来只有0.2ml的量又被 “L”棒蘸去部分，使菌落数受影响。
（3）菌落计数及报告注意事项
1）如果稀释度大的平板上菌落数反比稀释度小的平板上菌落数高，有两种可能性：一是检验工作中发生差错；二是受防腐剂影响。这二种情况均不可用作检样计数报告的依据。
2）如果平板上出现链状菌落，菌落之间没有明显的界限，这是在琼脂与检样混合时，一个细胞块被分散所造成。一条链作为一个菌落计，如有来源不同的几条链，每条链应作为一个菌落计，不要把链上生长的各个菌落分开来数。此外，如皿内琼脂凝固后未及时进行培养而遭受昆虫侵入，在昆虫爬过的地方也会出现链状菌落，也不应分开来数。
3）如果所有平板上都菌落密布，不要用多不可计报告，而应在稀释最大的平板上，任意数其中两个平方厘米中的菌落数，除以2求出lcm2内平均菌落数，乘以皿底面积63.6cm2，再乘以其稀释倍数。以此结果作报告，例如：10-1～10-3稀释度的所有平板上均菌落密布，而在10-3稀释度的平板上任意数两个平方厘米内的菌落数是60个，皿底直径为9cm，则该检样每克（或ml）中“估计”菌落数为：
60÷2×63.6×1000＝1.9×106
63.6是按皿底直径为9cm时计算而得的面积，如所用乎皿底直径不是9cm，应另求面积。
4）鉴于检样中的细菌是以单个、成双、链状或成堆的形式存在，因而在平板上出现的菌落可以来源于细胞块，也可来源于单个细胞，故平板上所得需氧和兼性厌氧的菌落数应以单位重量（g）或容量（ml）的菌落形成单位（Colony formingunits CFU）报告更恰当。

 

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