细菌染色标本检查法—革兰染色法

   
    细菌标本经染色后，与周围环境在颜色上形成鲜明的对比，可在普通光学显微镜下观察细菌的形态特征。 
1、实验材料 
（1）染色液结晶紫溶液、卢戈碘液、95%酒精、稀释石炭酸复红液。 
（2）菌种大肠杆菌和葡萄球菌6—12h肉汤混合培养物。 
（3）其他普通玻片、酒精灯、接种环等。 
2、实验方法 
（1）细菌标本片制备 
①涂片。取一张洁净载玻片，将变形杆菌液体培养物直接涂布于载玻片上；或先在载玻片上放置一接种环生理盐水，再取固体培养基上少许葡萄球菌与生理盐水磨匀，涂成直径1cm大小的区域。取菌量不可太多，使盐水磨成灰白色为宜。 
②干燥 。涂片最好在室温下自然干燥，或将标本面向上，置于酒精灯火焰高处慢慢烘干，切不可放在火焰上烧干。 
③固定。干燥后的标本片迅速通过火焰3次，既可达到杀菌的目的，又能固定细菌在玻片上，以免玻片上细菌在染色中被冲洗掉。 
（2）染色 
①初染。滴加结晶紫液2—3滴于涂片上，作用1min后，用细流水冲洗，甩干。 
②媒染。滴加卢戈碘液数滴于涂片上，作用1min后用流水冲洗，甩干。 
③脱色。滴加95%酒精数滴，轻轻晃动玻片，使玻片上流下的酒精液无紫色为止（时间灵活掌握，大约0.5min左右），用流水冲洗，甩干。 
④复染。滴加稀释石炭酸复红液数滴，作用1min后，用流水冲洗，甩干。最后用吸水纸印干标本片或 自然干燥后，玻片上滴加镜油，用显微镜油镜观察。 
3、实验结果 
   葡萄球菌最后被染成紫色，呈葡萄状排列；变形杆菌被染成红色，单个散在分布。 
4、影响因素 
（1）操作因素涂片太厚或太薄，菌体分散不均匀，可影响染色结果。固定时避免菌体过分受热。脱色时间要根据涂片厚薄灵活掌握。 
（2）染液因素：所有染液应防止水分蒸发而影响浓度，特别是卢戈碘液久存或受光作用后易失去媒染作用。脱色酒精以95%浓度为宜，若瓶密封不良或涂片上积水过多，可使酒精浓度下降而影响其脱色能力。
（3）细菌因素：不同时间培养物，革兰染色结果有差异，如葡萄球菌幼龄菌染成紫色，而老龄菌可被染成红色。细菌染色时一般用18—24h的细菌培养物为宜。

 

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