电镜负染观察病毒方法

   
   利用电子显微镜负染标本检测病毒，其优点为：可直接检测标本，简便易行；反差好，能提高分辨率；直观地显示组织或细胞内的病毒，染色后病毒仍保持活性。缺点是：机器价格昂贵，技术要求高，不太适用于常规病毒学诊断试验或大量标本的检测；病毒量较大时才易得到阳性结果，应用范围有限，且不能鉴别病毒的血清型。 
1、原理 
   负染方法是利用染液里的重金属离子为“染料”，由于病毒标本较重金属离子电子密度低。电子柬对重金属离子和病毒标本穿透能力不同，从而使病毒呈现明亮清晰的结构。 
2、材料 
①20g/l磷钨酸（PTA）。用双蒸馏水配制20g/l磷钨酸溶液，用1mol/lNaOH校正pH值为6.8。 
②涂有炭及聚乙烯醇缩甲醛的铜网。 
③平皿、滤纸、游丝镊子、微量毛细管。 
3、操作方法 
（1）标本制备 
①血清。血清0.2—1.0ml，用等量蒸馏水稀释，1500r/min离心，弃上清。沉淀重新悬浮，以肉眼可见折光为宜。 
②粪便。取粪便，制成1%悬液，3000r/min离心15—30min，弃沉淀。取上清1500r/min离心30—60min。取沉淀负染或免疫电镜观察。 
③尿液。取尿液5—10ml，3000r/min离心30—60min，弃沉淀。取上清液1500r/min离心60min，沉淀稀释后负染电镜检查。 
④痰液。痰液标本制备较困难，因为痰液中黏液扰乱背景。必要时，用磷酸盐缓冲液（PBS）1：4稀释。用匀浆器匀化后1500r/min离心60min，沉淀负染电镜观察。 
⑤脑脊液。蒸馏水等量稀释，负染电镜观察。 
⑥绒毛尿囊液。接种病毒培养的尿囊液1500r/min离心60min，沉淀负染电镜观察。 
⑦细胞培养。疑似病毒感染的细胞培养连同培养液一起收获，冻融数次或超声波破碎后，1500r/min离心60min，沉淀负染电镜观察。 
⑧组织块。用匀浆器或乳钵研磨，1500r/min离心60min，沉淀负染电镜观察。 
（2）PTA染色:处理后的标本滴在铜网上，滤纸吸去多余标本，滴加PYA染液，滤纸吸去多余染料，干燥后电镜观察。 
4、结果 
   显现病毒形态、结构。 
5、注意事项 
①超速离心后上清液必须充分吸干再用双蒸馏水制成悬液，否则残留的蛋白质干扰病毒颗粒的观察。 
②磷钨酸不能杀灭病毒，故标本制备后应在火焰上或沸水中消毒，用过的镊子、铜网也应消毒。 ③用过的铜网应用滤纸充分吸干残留标本，以免污染其他标本出现假阳性。 
④对未知病毒应将标本稀释不同倍数，选用清晰的悬液。

 

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