病毒组织培养技术1

     广义上的组织培养技术包括：器官培养、组织块培养和细胞培养。目前一般所指的组织培养多指细胞培养。根据细胞的来源、染色体特性和传代次数的不同可分为：原代和次代细胞培养、二倍体细胞株和传代细胞系。 
1、材料 
①无菌玻璃器皿。平皿、吸管、滴管、三角烧瓶、链霉素小瓶、胶塞等。 
②解剖器材。无菌小剪、镊子。 
③各种溶液。Hanks液、2.5g/l胰酶。细胞生长液 （0.5%水解乳蛋白88ml、双抗1ml、小牛血清10ml，用5.6%NaHCO3 0.8—1ml调至pH7.2），细胞维持液（0.5%水解乳蛋白95ml、双抗1ml、小牛血清3ml，用5.6%NaHCO3 0.8—1ml调至pH7.2左右）。 
④孵育9—11d鸡胚。 
⑤其他。血细胞计数器、离心机、水浴箱、消毒棉球等。 
2、方法 
（1）单层细胞的培养 
①取9—11d龄鸡胚用碘酒将卵壳消毒后，无菌操作取出鸡胚放于平皿内，去头、爪、内脏及骨骼，用Hanks液洗涤3次，除去残存血液。 
②将组织块移入链霉素小瓶内，用无菌剪刀将鸡胚剪碎成0.5—1.0mm3的小块，用含有双抗的Hanks液洗涤3次。 
③消化。加入5倍量的2.5g/l胰酶，置37℃水浴箱消化15min，用冷Hanks液洗涤1次，除去剩余的胰酶。 
④分散细胞。加入2ml生长液，用毛细管反复吹打，使细胞分散，加适量生长液稀释细胞悬液。 
⑤细胞计数。吸取0.1ml细胞悬液加0.8mlHank液及0.1ml（0.4%）台盼蓝染液，混匀后，滴入血细胞计数器内，按白细胞计数法计数细胞数。 
⑥细胞分装与培养。将细胞悬液分至4个小培养瓶中（每瓶1.5ml或根据细胞计数结果，用生长液将细胞稀释成300000——500000个/ml，加入小培养瓶内，放孵箱37℃培养。24—48h后显微镜下观察，见到生长成片的单层鸡胚成纤维细胞。 
（2）组织块培养：Maitland（1928）将鸡肾组织剪成小块悬浮于泰洛液及鸡血清中，静置于37℃培养，这种悬浮培养虽没有细胞生长，但能供病毒繁殖。 目前此法已不常用，但这种方法简便，不需胰酶消化，不怕振动，可携带至现场应用，并且组织块培养细胞维持时间较长，可能有利于慢病毒分离。 
   小组织块培养可分为悬浮培养和固定培养两种。 
①小组织块悬浮培养技术 
a、将组织剪成0.5—1.0mm3的小块。 
b、Hanks液洗3次，新鲜的组织块很容易粘贴于玻璃上。 
c、按10—15块组织加入1ml生长液的比例，在试管或瓶中培养。 
②小组织块固定培养技术 
a、小组织块制备同前。 
b、将洗液吸干，加入少量生长液。 
c、用毛细管约吸6—10块小组织块，分散放在试管壁下1/3最好成一直线。 
d、轻轻把细胞管旋转约180℃，使粘有组织的玻面向上，溶液流走。 
e、加入1ml生长液，不要与组织块接触。 
f、将细胞管斜放置37℃，此时组织块在玻璃上面，生长液在下面。 
g、在前几天，每天将细胞管轻轻旋转2，以润湿组织块。 
h、细胞开始由组织块长出后，可使生长液浸泡组织块继续培养。 
（3）器官培养：器官培养不是常规技术，但对某些病毒的分离鉴定有用，如用单层细胞未能分离出的冠状病毒，利用器官培养就能实现分离。例如，利用正常气管进行器官培养，纤毛运动即停止，纤毛细胞亦出现病变，最后脱落。有些病毒虽能在气管培养上繁殖，但对纤毛活动无明显的影响。 
①取5—9个月死胚的气管组织。 
②用含5倍浓抗生素的Hanks液洗3次，将组织包括黏膜和软骨，用锋利的刀或剪，剪成2—3mm3的块。 
③在直径60mm的平皿中放4—6块，使软骨在下，纤毛在上。 
④加入EagleMEM或199营养液，放5%CO2温箱培养。   
   
   

 

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