病毒组织培养技术2

   3、病毒的接种及检测 
  病毒常存在的部位有：鼻、咽、气管分泌物、粪便、组织器官、体液、脑脊液、血液。常用对病毒敏感的动物或细胞作为病毒分离的材料。拭子一般在取样后放入2ml加抗生素的肉汤中折断、涮洗，低温保存。用前将拭子中液体挤出，然后1500r/min离心15—20min，吸上清接种于细胞中。粪便标本一般用10倍Hanks液稀释，振荡使之乳化后2500r/离心15min，过滤后4℃1000r/min离心1h，取上清1.8ml，加入0.2ml抗生素4℃作用1h后接种细胞。虫媒蚊一般捕获后喂养5%葡萄糖水3d，待血食消化后，冻死。每50只为一批加入2—3ml5%酒精一生理盐水，4℃作用1h后用Hanks液洗3次，用无菌研磨器磨碎后加入Hanks液4℃1000r/min离心1h，取上清以备接种用。 
    细胞成片后，弃去生长液，Hanks液洗一次，接种上述处理后标本，加维持液使之能覆盖细胞，在培养温度下吸附1h后弃去，加维持液每日观察病变。 
    在组织培养中病毒的识别方法主要有细胞病变、蚀斑测定、红细胞吸附、干扰现象、中和试验、免疫荧光、细胞代谢改变、电镜观察等。 
（1）细胞病变：多数病毒在细胞内增殖，可引起细胞形态学改变，称为细胞病变效应。常见病变为细胞变圆、融合、坏死、溶解、脱落。有的病变表现为细胞变圆，堆积成葡萄状，如腺病毒；有的则表现为细胞融合，形成多核巨细胞，如麻疹病毒；有的细胞内出现包含体，如狂犬病病毒。 
    细胞病变的判断标准可根据出现病变的细胞在整个单层中所 占面积的比例进行判定。采用标准如下： 
+ 表示开始出现病变至少有25%细胞发生病变； 
++表示有25%—50%的细胞发生病变； 
+++表示有50%—75%的细胞发生病变； 
++++表示有75%—100%的细胞发生病变。 
   判定时必须对整个细胞单层进行全面的观察，然后加以判定。不能只看几个视野。因有些病毒感染可引起特殊的细胞病变，所以根据病毒所引起 的病变特点可进行初步推断，缩小鉴定范围。 
（2）蚀斑测定：这是一种检查和准确滴定病毒感染性的方法。将稀释的病毒悬液加入单层细胞培养瓶中，病毒吸附后，再覆盖一层融化的半固体营养琼脂，使病毒在单层细胞培养中有限扩散。结果是每一个有感染性的病毒在单层细胞中可产生一个局限性的感染灶 。用活性染料（如中性红）染色。则活细胞着色，受病毒感染而破坏的细胞不着色，形成肉眼可见的蚀斑。每一个蚀斑是 由一个感染性病毒颗粒形成的，称作蚀斑形成单位（PFU）。病毒悬液中的感染性病毒量的滴度可用PFU/ml表示。         
（3）红细胞吸附：流感病毒和副流感病毒感染的细胞膜上出现病毒基因编码的抗原，可以与红细胞结合。若向培养瓶内加入红细胞，可见红细胞吸附于细胞膜上，这种现象称为红细胞吸附现象。 
（4）干扰现象某些病毒感染细胞时不出现CPE或其他易于测出的变化（如HAD），但能干扰在其后感染的另一病毒的增殖。如风疹病毒感染Vero细胞后CPE不明显，但能干扰后感染的埃可病毒的增殖，从而阻抑后者特有的CPE。若细胞出现ECHOV感染所特有的CPE，则表示在细胞内无风疹病毒增殖。反之。若培养后Vero细胞不出现特有的CPE，则说明培养细胞中有风疹病毒增殖。 
（5）细胞代谢的改变：感染细胞的结果可使培养液的pH值改变，说明细胞的代谢在病毒感染后发生了变化。这种培养环境的生化改变也可作为判断病毒增殖的指标。 
（6）电镜观察：可用电子显微镜直接观察细胞内外的病毒，并可了解病毒的形态及大小。    
   
   

 

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