组织培养技术—组织培养原理2

   3、细胞培养的基本条件 
   单细胞在适当的培养条件下可迅速增殖。但若遇到不良环境细胞会变圆，停止生长，甚至死亡。细胞培养的基本条件主要包括：细胞接种量、培养液、pH值及气体条件、温度、无菌条件和培养器皿的清洁度。 
细胞接种量一般来讲，细胞量越大繁殖的速度越快，但太大的细胞量对于生长也不利。接种人肾和猴肾细胞量为300000ml，小鼠或地鼠肾细胞为500000ml，鸡成纤维细胞为1000000ml，传代细胞一般100000—300000ml。细胞一般可在3—7d长成单层。 
（2）合成培养液：以前多用天然培养液，现多用合成培养液。合成培养液有多种， 如Eagle液，RPMI1640，RPIM199。其主要成分为氨基酸、糖类、维生素、无机盐及其他成分。氨基酸是组成蛋白质的基本单位，所有组织培养液均需要12种氨基酸即精氨酸、组氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸、色氨酸、酪氨酸、缬氨酸、谷氨酸。Eagle液仅含有这12种氨基酸，RPMI1640、RPIM199、水解乳蛋白还含有其他氨基酸。 
    维生素是维持细胞生长和生物活性的物质，可作为酶的辅基或辅酶，对细胞代谢有重要影响。 
   糖类又称碳水化合物。所有组织培养液中均含有葡萄糖，它是细胞代谢的能量来源。 
    无机盐是细胞代谢必不可少的，是细胞的重要组成成分。所有用于组织培养的培养基均以无机 电解质为生理盐溶液，对于渗透压的维持、激活酶活性、缓冲等有重要作用。常用的生理盐溶液有Hanks液及Eagle液。 
   蒸馏水主要用于溶解上述物质。含有重金属的水对细胞有破坏作用，一般用双蒸水，去离子水亦可，但电导率须在10以下。 
   合成培养液中不含蛋白质成分，血清蛋白对组织培养是不可缺少的，不仅能促进细胞增长且能帮助细胞贴壁。不同血清对细胞促进作用不同，以小牛血清最好。每个批号血清使用前 需加热处理。一般经56℃30min灭活，并须了解有无细胞毒性作用。 10%血清营养液能促进细胞增殖。 
（3）pH值及气体条件：细胞生长最宜的pH值范围是7.0—7.4，细胞可忍受较大的范围pH值变化（pH6.6—7.8），培养环境偏酸较偏碱更宜于细胞贴壁。培养液中的缓冲体系主要是碳酸氢盐、磷酸氢盐和血清。其中碳酸氢盐/CO2为主要的缓冲体系。细胞代谢产生的各种酸使pH值下降，而培养液中的NaHCO3产生CO2排入空间又使pH值增加。pH值的变化主要取决于HCO3-浓度、CO2分压、细胞糖代谢能力。 
（4）温度：细胞培养的最适温度与细胞来源的动物体温一致。温度增加2—3℃对细胞产生不 良影响，使之在24h内死亡。低温对细胞影响较小。 
（5）无菌条件：培养液不仅对细胞是高度营养物，对于细菌和霉菌也是高度营养物。细胞培养中如污染微生物，其繁殖比细胞快并能产生毒素使细胞死亡。因此细胞培养技术的关键之一是防止污染。在细胞培养中，可能发生污染的来源有：组织培养液、器皿、组织本身、工作者本身、空气等。要对培养液、器皿用具、操作室进行彻底消毒。在操作时要严格实行无菌操作。各种器皿拿人操作台前，表面应用消毒液消毒，操作时在台上最好铺一块湿的来苏尔纱布以减少空间灰尘飞扬。无菌室、超净台用前须用紫外灯照射消毒。打开培养管前须在火焰上略烧一下瓶口以使灰尘固定，操作时必须将瓶、管斜放，吸管注入液体应避免和瓶口接触，操作时应禁止谈话。 
（6）培养器皿的处理：培养器皿处理的好坏与否对于细胞的贴壁生长影响很大。目前，常用的器皿主要有玻璃及塑料两大类 。玻璃器皿一般须用洁净液浸泡过夜，清水洗10次后再用蒸馏水洗2次，烤干备用。96孔或24孔塑料板一般用2%NaOH浸泡1h后，清水洗净再用1mol/lHCL浸泡1h，用清水洗后再用蒸馏水漂洗。37℃干燥后，紫外灯照射消毒。新橡皮塞须先用0.5mol的NaOH煮沸15min，洗涤后用4%HCL煮沸15min，清洗后用蒸馏水洗5次，煮沸10min灭菌。    
   
   

 

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