鸡胚培养技术—接种与收获

   （四）接种与收获 
1、材料 
①来亨鸡白色受精卵、卵架、检卵灯。 
②碘酒、酒精消毒棉球。 
③灭菌的手术刀、镊子、剪刀、平皿。 
④1ml注射器及6号针头、12号针头。 
⑤乙型脑炎病毒液、单纯疱疹病毒液。 
⑥流感病毒稀释液。 
⑦磨卵机、透明胶纸。 
2、方法 
   常用接种方法有四种，可根据病毒种类、接种目的不同，采用适当的接种途径。 
（1）卵黄囊接种法 
①取6—8日龄鸡胚，在检卵灯下画出气室和胎位，置卵盘上，气室端向上。 
②用碘酊、酒精消毒气室，然后用磨卵器在气室中央磨一小孔（用砂轮代替磨卵器也可）。 
③用碘酊、酒精消毒，以12ml注射器吸取乙型脑炎病毒液，针头自气室小孔朝胚胎相反方向旁侧斜刺入，深度3cm左右，即达卵中心卵黄囊内。注入量0.2—0.5ml，接种后以无菌蜡封闭小孔。根据接种病毒种类不同，置33—37℃温箱中培养，每天检卵一次。 
④取孵育24h以上濒死的鸡胚直立于卵盘上，钝端向上。气室部位用碘酊、酒精消毒后，用无菌镊子击破气室并除去卵壳。用另一无菌镊子夹破绒毛尿囊膜和卵膜，取出胚胎，然后夹住卵黄脐带处，小心收获卵黄囊。如制涂片，可从中剪一小块，轻涂于载玻片上，固定、染色、镜检。可放低温冰箱保存，备用。 
（2）绒毛尿囊膜接种法 
①取10—12日龄鸡胚，于检卵灯上画出气室与胎位，并在胎位无大血管处画一记号。 
②将卵直立于卵架上，钝端向上，先在气室部位用碘酊、酒精消毒，用磨卵器或砂轮在气室中磨一小孔，勿伤卵膜。 
③将卵平放，无大血管记号处向上，再依次用碘酊、酒精消毒记号处，用磨卵台或砂轮打一长为3—4mm的三角形小口，将卵壳取下，勿损伤壳膜，用注射针头在壳膜上划一小缝，勿伤绒毛尿囊膜，将一滴生理盐水滴于卵膜缝隙处。用针尖刺破气室囊膜，用大胶球自小孔处吸气造成负压，可见生理盐水下沉，绒毛尿囊膜即凹下，与壳膜已分开，人工气室制造成功。 
④用0.25ml或1ml注射器吸取单纯疱疹病毒液0.1—0.2ml，滴于绒毛尿囊膜上，用消毒的熔化石蜡封闭两口。蜡封部位向上，置37℃孵育4—5d。 
⑤将鸡卵取出后用碘酊、酒精消毒，以镊子揭去人工气室处卵壳并扩大开口，轻提绒毛尿囊膜，用剪子剪下接种面及周围的绒毛尿囊膜。置于加有无菌生理盐水的平皿中观察病变及作其他检验用。 
（3）尿囊腔接种法 
①常用9—12日龄鸡胚，检卵灯下画出气室界限，并在胚胎旁绒毛尿囊膜发育良好无大血管处和气室交界处画一记号。 
②用碘酊、酒精消毒，以磨卵器或砂轮磨一小孔，划破卵壳不损伤卵膜，以注射器吸取流感病毒液0.05—0.2ml，刺入壳膜少许，即可达尿囊腔。 
③以透明胶纸封闭注射孔，置35—36℃孵育3d取出。 
④为防止出血，收获前先将鸡胚置 ,4℃冰箱冷却7—12h。取出后用碘酊、酒精消毒气室端，以镊子式剪子沿气室周围除去卵壳，撕去壳膜。以毛细管或注射器穿破绒毛尿囊膜吸取尿液，置无菌瓶中备检。 
（4）羊膜腔接种法 
①取9—11日龄鸡胚，该部位接种，孵育鸡胚时，将气室端向上，让胎位接近气室，便于接种。在检卵灯下画出胎位、气室，用砂轮或磨卵器沿气室边缘和胚胎位置靠近处，开一道3mm的浅沟，并开一不损伤卵膜的孔。 
②用碘酊、酒精消毒，然后用无菌镊子揭去壳膜，并滴一滴无菌液体石蜡以使下面的膜透明，通过透明的膜，可清楚见到整个胚胎。 
③用注射器吸取标本，针头对准开口处向鸡胚直下，穿过绒毛尿囊膜、羊膜，进入羊膜腔，注入标本0.1—0.2ml，注射后用胶布封口，胶布下垫一无菌纸块，然后置35—37℃温箱孵育3—4d。 
④收获前将鸡胚置4℃冰箱7—12或-4℃冰箱30min，将鸡胚冻死，以减少收获时出血。撕去胶布，卵壳以碘酊、酒精消毒，用镊子撕去卵膜。左手持镊子夹住羊膜腔，右手用毛细管或带针头的注射器吸取羊水，放无菌小试管中备用。 
3、结果观察 
  检查接种标本后的鸡胚，是否被病毒感染，有两种方法：直接法和间接法。 
（1）直接法仅能看到绒毛尿囊膜上是否形成痘疮，鸡胚是否有特殊的病理变化，是否生长发育缓慢或死亡。如疱疹病毒在绒毛尿囊膜上可形成特殊 的痘疮；流行性乙型脑炎病毒、新城鸡瘟病毒可引起鸡胚死亡，可用作感染指标，但必须与接种损伤、标本毒性、细菌污染相区别。 
④接种损伤。接种损伤所引起的死亡，通常散在无规律性，病毒引起的死亡有潜伏期并有一定规律性。 
②标本毒性。毒性引起死亡，标本经稀释后，即不出现死亡。 
③细菌污染。污染引起死亡，尿液呈灰色、浑浊，鸡胚无光泽。 
④排除上述三种情况，可确认为临床诊断指标。 
（2）间接法：大部分需要鸡胚培养后收获，利用间接法。如流感病毒用尿液和羊水作血凝和血凝抑制试验；腮腺炎病毒用鸡胚的体液、组织及特异性诊断血清作补体结合试验；狂犬病病毒注入鸡胚脑内，收获后取脑组织作病理切片或直接涂片查找包含体。由于病毒种类不同，可选择不同方法作临床诊断指标。    
   
   

 

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