支原体分型试验的方法

（6）代谢抑制试验：根据特异性抗体能阻止支原体的生长及代谢这一特性，可采用已知高效价的免疫血清进行代谢抑制试验 以鉴别各种支原体。测定分解葡萄糖支原体时，可在含0.5——1.0%葡萄糖的支原体培养基中加入抗血清后再接种菌液，培养后未见发酵反应，培养基颜色不变；而未加抗血清的对照管呈发酵反应，培养基变成黄色。如加入的是抗肺炎支原体血清，即被检测的为肺炎支原体。代谢抑制试验还可用于感染支原体的患者血清抗体效价的检测。 
（7）反向血凝试验：取高效价的支原体抗血清先经50%硫酸铵沉淀初步提纯后，再经DEAE柱层析获得纯化IgG。先预试确定抗体致敏最适浓度，以鞣酸法将抗体包被于戊二醛化的绵羊红细胞上。抗体致敏的血细胞遇到相应抗原时，室温60min，则可出现特异的血细胞凝集反应。试验证明该法快速，1—2h即可获得结果，特异性和灵敏度高。 
（8）间接表面免疫荧光试验：此法的突出优点是能查出分离物中的混合感染株，而不需对分离物事先纯化。不需要制备各种支原体高免疫血清的荧光标记抗体，只要有一种羊抗兔荧光抗体即可。用特异性荧光抗体直接染色固体培养基上的支原体菌落，荧光显微镜检查被染菌落的荧光。当支原体菌落与同源兔抗支原体抗体结合后，再加羊抗兔荧光抗体，三位一体，在荧光显微镜下即可见典型的黄绿色荧光菌落。 
    先确定抗血清最适工作浓度，取支原体诊断血清用生理盐水制成不同稀释度（1：20—1：320），分别与已知相应的支原体菌落做间接表面免疫荧光试验，在荧光显微镜下以菌落着色荧光最强、背景最暗的抗血清最高稀释度作为最适工作浓度。 
    将待检菌株接种支原体固体培养基平板上，置二氧化碳条件下37℃培养5——7d，将带分散菌落的琼脂小心切下，菌面向下贴在洁净的载玻片上，每块玻片可放4—8个菌落。将玻片倾斜45°于80℃&蒸馏水容器中，约1min使琼脂块溶解滑下，立即用80℃蒸馏水清洗，并用pH7.2的PBS浸洗玻片3次；弃去洗液，室温干燥后，加入用pH7.2的PBS稀释至适宜浓度的抗血清；室温作用30min，用pH7.2PBS洗 3 次，每次30min，弃去洗液后加入适宜稀释的羊抗兔荧光抗体，作用30min后，用PBS洗 3 次，最后放4℃冰箱浸洗过夜；弃去洗液，待干后在荧光显微镜下观察菌落的荧光反应。菌落呈亮黄绿色特异性荧光，形态清晰者为阳性反应，属同源菌落；无荧光反应者为阴性。试验时应设阳性对照和加正常兔血清的阴性对照。间接表面免疫荧光试验具有较高的特异性和敏感性，缺点必须是活菌培养。 
（9）支原体菌数测定法：支原体的计数常采用 以下两种方法。 
①菌落形成单位（CFU）。将待检样品用支原体液体培养基以10倍递增稀释10（-1）——10（-12），取3个稀释度（10（-10）——10（-12））菌液0.1ml接种于直径5cm平板固体培养基上，每个稀释度接种平板 3 个，轻轻摇动平板，使菌液均匀铺平成圆形。置二氧化碳条件下37℃培育5—8天；在低倍或倒置显微镜下计数生长菌落，计算每毫升内生长的菌落数（CFU/ml）。 
②颜色改变单位（CCU）。根据支原体生化反应 的特性在培养其中添加葡萄糖（0.5%）、精氨酸（0.2%）或尿素（0.1%），同时加0.002%酚红指示剂；对分解葡萄糖支原体，培养基pH值调至7.8；分解精氨酸培养基pH值调至7.0；分解尿素的pH值调至6.0。试验方法是将培养基分装于无菌小试管中，每管1.8ml，第1管加入被检菌液0.2ml，混匀后吸取 0.2ml的至第2管，如此顺序进行10倍递增稀释10（-1）——10（-12），置37℃培育14d。以培养基颜色不继续发生改变为终点判定结果。以发生颜色变化的最高稀释度为颜色改变单位，如当10（-1）——10（-11）发生颜色改变，10（-12）无变化，即试验结果为CCU=10（-11），亦即被测菌液稀释至10（-11）仍有支原体生长。   
   

 

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