金黄色葡萄球菌肠毒素与多器官功能障碍综合征
姚咏明，盛志勇
(解放军第三○四医院烧伤研究所,北京100037)
临床资料表明,革兰阳性(G＋)菌脓毒症的发病率逐年上升，至20世纪90年代已达脓毒症发病率的40％以上，并仍有升高趋势。其中金黄色葡萄球菌(金葡菌)发病率位居首位，是烧伤创面感染、急性肝衰竭的重要病原菌。由于其致病因素复杂、耐药性不断增强，特别是中间型抗万古霉素金葡菌的出现，金葡菌感染所致脓毒症及多器官功能障碍综合征(MODS)的防治已成为现代创伤外科和危重病医学面临的棘手难题之一。我们回顾性调查了近5年间从创面分离的病原菌1 661株，其中金葡菌分离率从1995年的17.7%(居第3位)上升为1999年的29.3%(居第1位)；此外，278例次静脉内置管的严重烧伤患者，7例次发生导管脓毒症(5例死亡)，其分离病原菌中金葡菌占50%以上。由此可见，金葡菌是烧伤感染中最常见的菌种之一，其中耐甲氧西林金葡菌(MRSA)的耐药性强，易引起脓毒症和MODS等致死性并发症。细菌学研究表明，可溶性外毒素的产生是G＋菌感染的重要标志之一，在G＋菌感染性疾病的发生、发展中具有重要意义。其中金葡菌肠毒素因其"超抗原"(superantigen)特性以及在中毒性休克综合征、MODS发病中的特殊意义而倍受关注。
流行病学调查显示，从我院烧伤患者及医务人员手和鼻腔中分离出的127株金葡菌中，产毒率高达91.6%，而且以同时产生多种类型毒素者居多〔同时产肠毒素B、C (SEB、SEC)者最为常见〕，其中90%以上为耐药菌株。北京积水潭医院检测100株金葡菌肠毒素产生情况，结果表明总产毒率为68%，其中60株MRSA全部产一种或一种以上肠毒素，而40株非MRSA产毒率仅为20%。上述结果初步提示，产肠毒素金葡菌普遍存在于烧伤患者的创面、呼吸道，且MRSA较非MRSA有更强的毒力和致病性，对烧伤后并发金葡菌感染构成潜在的威胁。但迄今为止，关于金葡菌肠毒素在烧伤脓毒症及MODS发病中的变化特点及其作用机制尚缺乏足够的了解，导致这一领域进展缓慢的原因之一是缺乏敏感、快速的金葡菌感染检测手段。目前临床上常规的细菌培养与鉴定方法只能说明是否为金葡菌感染，而金葡菌产毒试验也仅是观察细菌在体外的产毒情况，并不能反映其在体内的生物活性及致病特点，且该方法耗时较长，致使金葡菌感染的早期诊断非常困难，误诊的情况时有发生。因此，建立敏感、快速的金葡菌肠毒素检测方法用以直接监测外毒素在体内的变化特点，将有助于金葡菌感染所致脓毒症及MODS的早期识别与诊断，并可望对金葡菌肠毒素致病机制和临床意义的认识获得新的进展。
我们采用改良双单抗夹心酶联免疫吸附试验(BA-ELISA)方法检测动物血浆及组织匀浆中SEB，利用单克隆抗体的特异性和生物素-链亲素系统的放大原理，使该方法的检测灵敏度显著升高，可达0.078μg/L，检测范围为0.078~20.0μg/L，血浆中SEB的回收率为88.7%~106.2%。建立该方法为进一步研究SEB在体内的生物学效应奠定了技术基础。为此，我们采用大鼠20％体表面积Ⅲ度烫伤合并金葡菌攻击所致严重脓毒症模型，探讨了SEB在脓毒症和多器官功能损害中的变化规律及致病机制。结果显示，烧伤后金葡菌感染动物血浆SEB水平迅速升高，并于6小时达峰值，其后迅速下降，但至24小时仍明显高于伤前值；而心、肝、肺、肾等组织中SEB含量持续上升，其中24小时升高幅度最为明显。与其它组织相比，金葡菌严重脓毒症时肝、肾组织中SEB含量明显高于其它脏器，表明肝、肾可能是SEB蓄积的主要场所。由于SEB可经肾小球自由滤过，并被近端肾小管细胞完全重吸收，因此肾脏在肠毒素清除中的作用可能尤为重要。据报道，肾动脉结扎和肾切除均可导致体内肠毒素的清除延迟，增强其对动物的致死能力。给家兔静脉注射125I标记的肠毒素A后,循环中肠毒素迅速清除，并分布到肝、肾、肺、脾等组织，其中肾脏含量最高。上述结果进一步证实肾脏是肠毒素蓄积和排泄的最重要场所之一。
研究表明，SEB作为"超抗原"具有很强的丝裂原性，极低浓度即可致T淋巴细胞大量活化、促炎细胞因子产生显著增加，对金葡菌脓毒症和MODS的病理生理过程可能具有重要的促进作用。我们的资料证实，SEB对家兔肝脏等多个器官的功能具有直接损害效应。为了探讨SEB在烧伤脓毒症所致MODS中的作用，我们选取心、肝、肺、肾、肠等重要器官，分析了SEB与器官功能改变的关系。结果显示，单纯烧伤打击后24小时，动物心、肝、肺、肾功能明显异常，但反映小肠黏膜完整性的小肠组织二胺氧化酶活性无明显改变。烧伤合并金葡菌攻击后动物肝、肾和心功能损害进一步加剧，肺组织中性粒细胞聚集明显增加；同时，小肠组织二胺氧化酶活性呈持续下降趋势，提示小肠黏膜的完整性亦严重受损。病理形态学检查证实，烧伤后金葡菌感染动物心、肝、肺、肾、肠等组织均可见不同程度的炎性细胞浸润和坏死性病变，其中肺脏改变尤为显著。进一步分析发现，早期给予抗SEB单克隆抗体可有效降低血浆及组织中SEB水平，同时心、肝功能指标显著降低，小肠组织二胺氧化酶活性基本恢复至伤前范围。值得注意的是，抗SEB单克隆抗体干预组动物早期死亡率明显降低。上述结果表明，随着组织中SEB含量的降低，动物相应器官功能和预后亦在一定程度上得以改善，从而证实了SEB在MODS中具有重要作用。由此可见，烧伤合并金葡菌攻击可导致动物多器官功能损害进一步恶化，其改变与脏器组织中SEB含量持续升高密切相关。
业已明确，T淋巴细胞的大量活化是肠毒素所致脓毒症与MODS重要特征之一。而干扰素-γ(IFN-γ)是活化T淋巴细胞产生的一种强有力的免疫调节因子，在调节单核/巨噬细胞和内皮细胞功能方面作用显著。故推测它在金葡菌脓毒症及MODS的病理生理过程中可能具有重要意义。我们的实验结果显示，烧伤合并金葡菌攻击后0.5小时，肝、肺等组织中IFN-γ mRNA表达明显增加，至24小时仍处于较高水平。与之相似，伤后组织和血浆中IFN-γ含量亦迅速升高。相关分析表明，肺组织IFN-γ水平与肺脏SEB的含量呈显著正相关，但内毒素的改变与之无相关性。同时，早期给予抗SEB单克隆抗体可显著抑制血浆及肺组织中IFN-γ的产生，从而证实SEB可能参与了IFN-γ的诱生过程。上述结果表明，烧伤后金葡菌攻击可导致不同组织中IFN-γ基因及蛋白质表达广泛上调，其改变与组织SEB的直接刺激作用有关。进一步分析可见，烧伤后金葡菌感染动物肝、肺、肾组织中IFN-γ含量与相应脏器中肿瘤坏死因子-α (TNF-α) 浓度呈高度正相关，同时肺脏IFN-γ含量与局部组织中一氧化氮水平亦呈正相关关系。表明IFN-γ可通过上调TNF-α和一氧化氮等介质的诱生在金葡菌脓毒症所致MODS中具有促进作用，抗SEB单克隆抗体干预对动物脏器功能的保护效应与其在一定程度上抑制IFN-γ的产生有关。有资料证实，SEB攻击小鼠后体内IFN-γ水平明显升高，并与一氧化氮的过度合成与释放密切相关；利用抗IFN-γ特异性抗体进行早期拮抗能有效抑制一氧化氮的产生，同时动物预后明显改善，进一步证实了IFN-γ对机体的损害作用。
金葡菌的致病成分较G－菌更为复杂，包括细菌细胞壁成分、胞外酶和外毒素等多种因子。其中肠毒素为金葡菌产生的主要外毒素之一，它在脓毒症和MODS发生中的作用及其机制日益引起人们的关注。一般认为，肠毒素属"超抗原"，具有强大的抗原刺激能力，且以T淋巴细胞为主要靶细胞。与普通抗原相似，SEB也可与抗原提呈细胞表面的主要组织相容性复合物Ⅱ类分子(MHCⅡ)结合形成复合物。其结合部位位于抗原结合槽以外的区域，因此可不经加工直接与T淋巴细胞抗原受体的β链V区(TCR Vβ)结合。由于TCR Vβ区仅存在有限的基因，核苷酸序列非常保守，同一个体内的许多T淋巴细胞可具有相同的Vβ成分，因此单一的肠毒素在极低浓度(1~10 μg/L)即可激活大量T淋巴细胞(可达全部T淋巴细胞的5%~10％，甚至40％)。活化的T淋巴细胞释放大量促炎细胞因子(如TNF-α、IFN-γ)，最终导致炎症失控和MODS的发生。目前研究认为，SEB诱导T淋巴细胞活化有两种方式，即TCR Vβ限制性方式和不依赖TCR的方式。正常静息状态的T淋巴细胞不表达MHCⅡ类分子，SEB必须先与抗原提呈细胞上的MHCⅡ类分子结合，形成毒素-MHCⅡ分子复合物，后者直接与TCR的特异性Vβ链结合，经磷酯酰肌醇二磷酸和环磷酸鸟苷等信号转导途径诱导T淋巴细胞的活化与增殖，导致炎性细胞因子的大量合成和释放。与内毒素所致脓毒症及MODS不同，T淋巴细胞活化和增殖产生TNF-α、IFN-γ是介导SEB损伤效应的关键环节，而G－菌脓毒症中TNF-α诱生主要由单核/巨噬细胞所介导。
众多研究证实，急性创、烧伤和休克打击可导致胃肠道黏膜屏障功能受损、免疫抑制和肠道菌群改变，三者相互作用可促使肠源性内毒素移位至远隔器官，在烧伤脓毒症和MODS的发病中具有重要意义。有关资料亦显示，尽管G+菌本身不能产生内毒素，但许多G+菌脓毒症或MODS患者常伴有内毒素血症的出现，并与G+菌致病因子协同致病，对MODS的发生与发展具有促进作用，但其确切的作用机制仍有待探索。动物实验结果表明，当肠毒素与内毒素共同作用时，可使各自的致死剂量均降低100倍，而且体内TNF-α、IFN-γ和白介素-6(IL-6)等炎症介质的水平更高、持续时间更长。近年来大量研究揭示，肠毒素和内毒素的靶细胞虽各不相同 (分别为T淋巴细胞和单核/巨噬细胞)，但均可通过各自的细胞表面受体(TCR和CD14)激活细胞内多条信号转导途径，最终导致核因子-κB (NF-κB)、信号转导与转录激活子(STAT)等核转录因子的活化，后者作为信号转导途径的最后"共同通路"，调节着体内多种炎症介质的基因转录。由此看来，金葡菌致病因子与内毒素激活炎性细胞的信号转导存在着某些共同途径，这可能是二者在脓毒症和MODS发病中具有协同作用的重要病理生理学基础。以往研究亦证明，肠毒素活化T淋巴细胞产生的IFN-γ作为强有力的免疫调节剂可增强单核/巨噬细胞内信号转导途径各种激酶的活化程度，促进TNF-α等炎症介质的合成与释放，在肠毒素与内毒素的协同作用中起着关键的调节作用。进一步观察发现，IFN-γ可显著增强脂多糖诱导的核转录因子NF-κB的活化、促进其与DNA结合，而脂多糖反过来也可增强IFN-γ所介导的STAT-1的活化，表明二者是通过对信号转导途径的交汇调节(cross-regulate)而产生协同效应。此外，TNF-α抗体和IL-1受体拮抗剂可有效抑制IFN-γ和脂多糖的协同效应，表明IFN-γ和脂多糖介导生成的TNF-α、IL-1等细胞因子本身还可通过"自分泌环"对协同效应起到一定的促进作用。由此可见，在金葡菌感染诱发脓毒症和MODS病理过程中，肠毒素、内毒素及其介导的细胞因子在信号转导水平相互调节、相互促进，可能是协同效应的发生机制之一。应当指出的是，创、烧伤后金葡菌的致病因子较为复杂，除肠毒素外，金葡菌细胞壁成分(如肽聚糖和磷壁酸)在失控性炎症反应及MODS中的地位亦不容忽视，其确切的病理生理意义有待于深入探讨。
作者简介：姚咏明(1965-),男(汉族),湖北省人,博士后,教授。主要从事创伤休克、脓毒症和多器官功能障碍综合征发病机制及防治的研究。
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