军团菌的鉴定

 军团菌属是一种具有高度暴发流行性呼吸道疾病的病原菌，为革兰阴性胞内寄生菌。 
【材料】 
1、菌种嗜肺军团菌4—10天的培养物。 
2、培养液BCYE平板（酵母浸膏、半胱氨酸、硝酸铁培养液 ），F-G平板（费-高改良M-H培养液），血平板，巧克力色血平板及各种生化反应培养液。 
3、试剂相应生化反应检测试剂。 
4、诊断菌液军团菌标准株可溶性抗原、军团菌致敏红细胞。 
5、其他：革兰染液、鞭毛染液、姬美尼兹染液、苏丹黑染液等。 
【方法】 
1、鉴定程序： 
2、形态观察革兰染色：幼龄菌为革兰阴性短小杆菌，培养数日后可见多形性和长丝状。革兰染色还可见菌体有空泡。鞭毛染色可见1—2根单鞭毛和侧鞭毛，无荚膜、无芽胞。 
3、培养特性观察：将待检菌接种BCYE平板、F-G平板、血平板和巧克力（色）血平板上，须置37℃，2.5%二氧化碳，需氧高湿度环境下培养37天。如果在48小时内出现菌落或在这些培养液上均生长，则不是军团菌，如果仅在BCYE或F-G平板上生长，另外两种平板上不生长，而且至少在72小时以后出现菌落，则可能是军团菌。在BCYE平板上4—5天可形成针尖大小的菌落，继续培养数日后菌落直径可增大至4—5mm。菌落灰白色、圆形、湿润、有光泽、边缘透明。呈刻花玻璃样条纹为其特征。菌落较为黏着，并有特有的酸臭味。在紫外线可见表面呈现白色自发荧光。在F-G平板上培养10天才见生长，并可产生棕色色素。 
4、生化反应触酶、氧化酶、β-内酰胺酶及马尿酸水解实验均阳性，不分解糖类产酸、脲酶及硝酸盐还原实验阴性。 
5、气相色谱显示军团菌的细胞脂肪酸组成，易与其他细菌区别。 
6、血清学检查 
（1）微量凝集实验：首先将军团菌标准株接种于BCYE或其他专用培养液上，35℃2.5%二氧化碳，需氧高湿度环境下培养3—4天，用0.01mol/l、pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS）洗下菌苔，沸水浴1小时杀菌。2000rpm离心10分钟后弃去上清液。用含0.5%福尔马林的磷酸盐缓冲液配成悬液，使其浓度在420nm波长，光径1cm时吸光度值为0.65，即为诊断菌液。诊断菌液在用前加石炭酸复红液1ul。 
   在微量血凝反应板上，将待测患者血清用0.01mol/l、pH7.4磷酸盐缓冲液（PBS）作2倍连续稀释，每孔25ul，然后各孔加入诊断菌液25ul，混匀1分钟，置湿盒室温过夜。 
   目视判定结果，以50%（+ +）凝集为终点，引起50%凝集的血清最高稀释度的倒数为其滴度。 
（2）间接血凝实验：将军团菌标准株接种于BCYE或其他专用培养液上，35℃2.5%CO2需氧高湿度环境下培养3—4天，用0.01mol/l、pH7.4洗下菌苔，沸水浴1小时杀菌。4℃冷浸7—10天，2000rpm离心15分钟，上清液即为可溶性抗原，加叠氮钠至1.0g/l，4℃保存。 
    取甲醛、丙酮醛双醛醛化绵羊红细胞0.1ml，加最适稀释度可溶性抗原（以预实验选取出现特异性凝集的最高稀释度），用0.01mol/l、pH7.4稀释至1ml，37℃水浴1小时致敏，用PBS洗3次，以含1.0g/l明胶、0.4g/l牛血清清蛋白、0.5%羊红细胞膜的0.01mol/l、pH7.4的PBS配成0.75悬液，即为致敏红细胞。 
    在微量血凝反应板上，将待测患者血清用PBS作2倍连续稀释，每孔25ul，各孔补加PBS25ul，将微量反应板置振荡器上，边振荡边加人致敏红细胞（每孔滴加25ul），混匀1分钟，置湿盒内于室温2小时后判定结果。 
    目视判定结果，以50%（+ +）凝集为终点。出现50%凝集的血清最高稀释度的倒数为效价。 
（3）直接荧光抗体染色：涂片干燥后，滴加FTTC标记的抗军团菌多价或相应单价抗体染色，荧光显微镜下可见有强烈黄绿色荧光的细菌。   
   

 

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