形态及菌落观察

【原理】  支原体形态多为球形小颗粒和较短的丝状体，不易鉴别。 
    溶脲脲原体（Uu）在含95%氮气和5%二氧化碳环境中生长良好。其生长最适pH为5.5—6.5，最适温度为36—37℃。Uu具有脲酶，能分糖尿素产氨，使含酚红指示剂的Uu液体培养液pH上升，颜色由黄色变为红色。再将液体培养物转种到Uu固体培养液上，能生长成具特征性荷包蛋样菌落。 
1、液体培养液支原体肉汤培养液80ml，马血清或小牛血清10ml，酵母浸液10ml，10%尿素溶液0.5—1.5ml，0.4%酚红溶液0.5ml，青霉素（使其在培养液中的浓度为500—2000U/ml）用1mol/l氯化氢调pH至5.5—6.5，用小试管分装后置冰箱中备用，每管1.52.0ml。接种标本后，经孵育，若培养液发生由黄变红的颜色变化，透明无混浊（有别于某些细菌及真菌生长）则可初步判断为有支原体生长。大多数Uu在24小时内可获得阳性结果。 
2、固体培养液在200ml支原体肉汤培养液中，加入琼脂1.2—1.4g，高压灭菌后冷却到50℃左右，逐一加人上述添加剂。摇匀，倒人无菌平皿中，待凝固后，置冰箱中备用。Uu在固体培养液上菌落核心呈粗颗粒状，具极窄的边，有时呈荷包蛋样。 
    人型支原体（Mh）在有氧及无氧环境中均能生长，在液体培养液中2—3日可见生长，固体培养液上培养4—5日即可生出菌落。生长条件除需胆固醇外，尚需要精氨酸。生长的最适pH为7.0，最适温度36—37℃,Mh具有精氨酸脱氢酶，能水解精氨酸产氨，使含酚红指示剂的Mh液体培养液pH值上升，呈碱性，颜色由橙黄色变为红色。Mh和Uu一样，不发酵葡萄糖，这与生殖支原体有区别。将液体培养物转种到固体培养液上，能生长成具有特征性的荷包蛋样菌集落。培养液中不加尿素，需加入精氨酸，其他营养成分与Uu相同。观察结果同Uu。 
    生殖支原体（Mg）能发酵葡萄糖和其他碳水化合物，使培养液pH下降呈酸性，可使含酚红指示剂的培养液出现由红色变为黄色的变化，但即使降至6.0以下，Mg仍可存活。Mg不能分糖精氨酸及尿素。它营养要求复杂，须在不含醋酸铊的SP-4培养液中才能生长，而且生长极缓慢。Mg在固体培养液上，置于含5%—10%二氧化碳和90%—95%的氮环境中，可形成荷包蛋样集落。 
    肺炎支原体（Mp）以牛心消化液为基础，加20%小牛血清及新鲜酵母浸液制成的液体或固体培养液。加入青霉素，可防止杂菌生长。初次分离生长缓慢，在含5%二氧化碳下培养，10天长出荷包蛋状菌落。能发酵葡萄糖产酸，不能利用精氨酸与尿素，可还原美蓝，分离培养阳性率不高。 
【材料】以溶脲脲原体为例。 
1、支原体固体培养液。 
2、溶脲脲原体固体培养液。 
3、姬姆萨染色液。 
【方法】 
1、标本采集女性：用扩阴器扩阴后，以无菌拭子取宫颈口分泌物，也可以取羊水，不推荐用尿液；男性：以无菌拭子取尿道分泌物、前列腺按摩液、精液或中段尿培养（中段尿10ml经2000r/min离心10分钟），取沉渣接种。 
2、接种好的培养液，置于35—37℃含5%—10%二氧化碳培养2—3天，每天观察结果。 
3、菌落染色镜检。 
（1）用低倍镜在平板上选择一个菌落，用刀片切下带菌落的琼脂块，置于一载玻片上，菌落面朝下。 
（2）将载玻片放入80—85℃的水中，见琼脂发白脱落后取出玻片。 
（3）自然干燥，姬姆萨染色（染液作1;20稀释，需染3小时以上）。 
【结果】  经过培养，标本阳性时，培养液呈红色，低倍镜下姬姆萨染色观察，可见菌落被染成蓝色，中央深、四周较浅，形状似荷包蛋样。   
   

 

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