中华人民共和国国家标准食品卫生微生物学检验蜡样芽胞杆菌检验

主题内容与适用范围  
     本标准规定了蜡样芽胞杆菌的检验方法。  
     本标准适用于食品和食物中毒样品中蜡样芽胞杆菌的检验。  
2  引用标准  
    GB 4789.2  食品卫生微生物学检验  菌落总数测定  
    GB 4789.28  食品卫生微生物学检验  染色法、培养基和试剂  
3  设备和材料  
3．1  温箱：36±1℃。  
3．2  普能冰箱。  
3．3  显微镜。  
3．4  恒温水浴46±1℃。  
3．5  天平。  
3．6  电炉。  
3．7  吸管：1 mL，10 mL。  
3．8  载玻片。  
3．9  均质器或乳钵。  
3．10  L 型涂布棒。  
3．11  灭菌刀，剪，镊子。  
3．12  三角瓶：容量 500 mL。  
4  培养基和试剂  
4．1  肉浸液肉汤培养基：GB 4789.28 中4.1。  
4．2  酪蛋白琼脂培养基：GB 4789.28 中4.65。  
4．3  动力-硝酸盐培养基：GB 4789.28 中4.72。  
4．4  缓冲葡萄糖蛋白胨水：GB 4789.28 中3.4。  
4．5  血琼脂培养基：GB 4789.28 中4.6。  
4．6  3%过氧化氢溶液。  
4．7  甲萘胺-乙酸溶液。  
4．8  对氨基苯碘酸-乙酸溶液。  
4．9  革兰氏染色液：GB 4789.28 中2.2。  
4．10  甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂培养基：GB 4789.28 中4.64。  
4．11  0.5%碱性复红染色液：GB 4789.28 中2.8。  
4．12  木糖-明胶培养基：GB 4789.28 中4.66。  
5  操作步骤  
6  操作步骤  
6．1  菌数测定  
    以无菌操作将检样 25 g（mL）（按 GB 4789.2 测定），用灭菌生理盐水或磷酸盐缓冲液做成 10（-1） ～10（-5） 的稀释液。取各稀释液 0.1 mL，接种在两个选择性培 
养基——甘露醇卵黄多粘菌素（MYP）琼脂培养基上，用L 形棒涂布于整个表面，置 36±1℃温箱培养基 12～20 h 后选取适当菌落数的平板进行计数，蜡样芽胞杆菌在此培养基上的菌落为粉红色（表示不发酵甘露醇）周围有粉红色的晕（表示产生卵磷脂酶）。计算后，从中挑取 5 个此种菌落做证实试验。根据证实为蜡样芽胞杆菌的菌落数计算出该平板上的菌落数，然后乘其稀释倍数，即得每克（或毫升）样品中含蜡样芽胞杆菌数，例如 MYP 平板的可疑菌落数为25个，取5个鉴定，证实为4个，乘上稀释倍数（如10），再乘上 1 g（或 mL）检样数（取的是0.1 mL 样）则为：   
                 25×4/5×10（4） ×10=2×10（6） 
6．2  分离培养  
    取检样或稀释液划线分离培养于选择性培养基（MYP）上，置37℃培养12～20 h，挑取可疑的蜡样芽胞杆菌菌落（见6.1）接种于肉汤和营养琼脂做成纯培养，然后做证实试验。  
6．3  证实试验  
6．3．1  形态观察  
    本菌为革兰氏阳性大杆菌，宽度在 1μm或1μm以上，芽胞呈卵圆形，不突出菌体，多位于菌体中央或稍偏于一端。  
6．3．2  培养特性  
    本菌在肉汤中生长混浊，常微有菌膜或壁环，振摇易乳化；在普通琼脂平板上生成的菌落不透明、表面粗糙、似毛玻璃状或融蜡状，边缘不齐。  
6．3．3  生化性状及生化分型  
6．3．3．1  生化性状  
    本菌有动力；能产生卵磷脂酶和酪蛋白酶；过氧化氢酶试验阳性；溶血；不发酵甘露醇和木糖；常能液化明胶和使硝酸盐还原；在厌氧条件下能发酵葡萄糖。  
6．3．3．2  生化分型  
蜡样芽胞杆菌可根据对柠檬酸盐利用、硝酸盐还原、淀粉水解、V-P反应、明胶液化性状的试验，将该菌分成不同的型别。
表 1   蜡样芽胞杆菌生化分型  
                                        生化试验  
  型别  
            柠檬酸盐利用   硝酸盐还原  淀粉水解     V-P 反应     明胶液化 
    1             +              +        +             +           +  
    2             -              +        +             +           +  
    3             +              +        -             +           +     
    4             -              -        +             +           +  
    5             -              -        -             +           +  
    6             +              -        +             +           +  
    7             +              -        -             +           +  
    8             -              +        -             +           +  
    9             -              +        -             -           +  
   10             -              +        +             -           +  
   11             +              +        +             -           +  
   12             +              +        -             -           +  
   13             -              -        +             -           -  
   14             +              -        -             -           +  
   15             +              -        +             -           + 
表 2   蜡样芽胞杆菌与其他类似菌的鉴别
项目 巨大芽胞杆菌 蜡样牙胞杆菌 苏云金芽胞菌 蕈状芽胞杆菌 炭疽芽胞杆
过氧化氢酶 + +   +        +           +
动力          ± ±   ±        -           -
硝酸盐还原 - +   +        +           +
酪蛋白分解 ± +   ±        ±           ±
卵黄反应          - +    +         +            +
葡萄糖利用厌氧 - +    +         +        +
甘露醇          + -    -         -     -
木糖         ± -    -          -   -
溶血          - +    +         ±   ±
已知致病菌特性  产生肠毒素 对昆虫致病的内毒素结晶 假根样生长 对动物和人致病    
注：+90%～100%的菌株阳性；-90%～100%的菌株阴性；±大多数菌株阳性；-（+）大多数菌株阴性。  
本菌在生化性状上与苏云菌芽胞杆菌极为相似，但后者可籍细胞内产生蛋白质毒素结晶加以鉴别。其检查方法如下：取营养琼脂上纯培养物少许，加少量蒸馏水涂于玻片上，待自然干燥后用弱火焰固定，加甲醇于玻片上，半分钟后倾去甲醇，置火焰上干燥，然后滴加 0.5%碱性复红液，并用酒精灯加热至微见蒸气维持 1.5 min，移去酒精灯，将玻片放置半分钟，倾去染液，置洁净自来水充分漂洗，晾干，镜检，在油浸镜下检查有无游离芽胞和深染的似菱形的红色结晶小体（如未形成游离芽胞，培养物应放室温再保存 1～2 d后再检查），如有即为苏云金芽胞杆菌，蜡样芽胞杆菌检查为阴性。

 

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