中华人民共和国国家标准 食品卫生微生物学检验致泻大肠埃希氏菌检验2

6、操作步骤
6.1增菌样品采集后应尽快检验。除了易腐食品在检验之前预冷藏外，一般不冷藏。以无菌操作取检祥25g(mL)，加在225mL营养肉汤中，以均质器打碎1min或用乳钵加灭菌砂磨碎。取出适量，接种乳糖胆盐培养基，以测定大肠菌群MPN，其余的移入500 mL广口瓶内，于36℃ 士1℃ 培养6h。挑取1环，接种于1管30mL肠道菌增菌肉汤内，于42℃培养18h。6.2分离将乳糖发酵阳性的乳糖胆盐发酵管和增菌液分别划线接种麦康凯或伊红美蓝琼脂平板；污染严重的检样，可将检样匀液直接划线接种麦康凯或伊红美蓝平板，于36℃ 士l℃培养18h——24卜，观察菌落。不但要注意乳糖发酵的菌落，同时也要注意乳糖不发酵和迟缓发醉的菌落。6.3生化试验6.3.1自鉴别平板上直接挑取数个菌落分别接种三糖铁琼脂（TSI）或克氏双糖铁琼脂（KI）。同时将这些培养物分别接种蛋白陈水、半固体、pH7.2尿素琼脂、KCN肉汤和赖氨酸脱梭酶试验培养基。以上培养物均在36℃ 培养过夜。6.3.2 TSI斜面产酸或不产酸，底层产酸，H2S阴性，KCN阴性和尿素阴性的培养物为大肠埃希氏菌。TSI底层不产酸，或HZS、KC绮、尿素有任一项为阳性的培养物，均非大肠埃希氏菌。必要时做氧化酶试验和革兰氏染色。6.4血清学试验6.4.1假定试验：挑取经生化试验证实为大肠埃希氏菌琼脂培养物，用致病性大肠埃希氏菌、侵袭性大肠埃希氏菌和产肠毒索大肠埃希氏菌多价O血清和出血性大肠埃希氏菌0157血清做玻片凝爽试验。当与某一种多价O血清凝集时，再与该多价血清所包含的单价O血清做试验。致泻大肠埃希氏菌所包括的O抗原群见表1。如与某一个单价O血清呈现强凝集反应，即为假定试验阳性。表1致泻大肠埃希氏菌所包括的O抗原群
大肠埃希氏菌的种类   所包括的O抗原群
  EPEC               O26 O55 O86 OO111ab O114 O119 O125ac O127 O128ab 
                     O142 O158
  EHEC               O157
  EIEC               O28ac O29 O112ac O115 O124 O135 O136 O143 O144 O152
                     O164 O167 
  ETEC               O6 O11 O15 O20 O25 O27 O63 O78 O85 O114 O115 O126 
                     O128ac O148 OO149 O159 O166 O167    
6.4.2证实试验：制备O抗原悬液，稀释至与Mac Farland3号比浊管相当的浓度。原效价为(1：160)——(1：320）的O血清，用0.5％盐水稀释至1：40。稀释血清与抗原悬液在10mm*75mm试管内等量混合，做单管凝集试验。混匀后放于50℃ 水浴锅内，经16h后观察结果。如出现凝集，可证实为该O抗原。6.5肠毒素试验6.5.1酶联免疫吸附试验检测LT和ST 6.5.1.1产毒培养：将试验菌株和阳性及阴性对照菌株分别接种于0.6mlCAYE培养基内，37℃振荡培养过夜。加人20000IU/mL的多粘菌素B 0.05mL，于37℃lh，离心4000r/min 15min，分离上清液，加人0.1％硫柳汞0.1%肠mL，于4℃保存待用。6.5.1.2 LT检测方法（双抗体夹心法）:a）包被：先在产肠毒素大肠埃希氏菌LT和ST酶标诊断试剂盒中取出包被用LT抗体管．加入包被液0.5mL，混匀后全部吸出于3.6ml包被液中混匀，以每孔100ul量加人到40孔聚苯乙烯硬反应板中，第一孔留空作对照，于4℃ 冰箱湿盒中过夜．b）洗板：将板中溶液甩去，用洗涤液1洗三次，甩尽液体，翻转反应板，在吸水纸上拍打，去尽孔中残留液体。c）封闭：每孔加100拜L封闭液，于37℃水浴中lh。d）洗板：用洗涤液II洗三次，操作同上．e）加样本：每孔分别加各种试验菌株产毒培养液100ul, 37℃水裕中1h.f）洗板：用洗涤液II洗三次，操作同上。g）加酶标抗体：先在酶标LT抗体管中加0.5mL稀释液，混匀后全部吸出于3.6ml稀释液中混匀，每孔加100ul, 37℃水浴中lh。h）洗板：用洗涤液II洗三次，操作同上。i）酶底物反应：每孔（包括第一孔）各加基质液100ul，室温下避光作用5min——10min，加人终止液50uL。j）结果判定。以酶标仪在波长492nm下测定吸光度OD值，待测标本创，值大于阴性对照3倍以上为阳性，目测颜色为桔黄色或明显高于阴性对照为阳性。6.5.1.3 ST检测方法（抗原竞争法）:a）包被：先在包披用ST抗原管中加0.5mL包被液，混匀后全部吸出于1.6mL包被液中混匀，以每孔加50ul加人于40孔聚苯乙烯软反应板中。加液后轻轻敲板，使液体布满孔底。第一孔留空作对照，置4℃冰箱湿盒中过夜。b）洗板：用洗涤液I洗三次，操作同上．c）封闭：每孔加100ul封闭液，37℃ 水浴lh。d）洗板：用洗涤液II洗三次，操作同上。e）加样本及ST单克隆抗体：每孔分别加各试验菌株产毒培养液50ul，稀释的ST单克隆抗体50ul（先在ST单克隆抗体管中加0.5二L稀释液，混匀后全部吸出于1.6 mL稀释液中，混匀备用）, 37℃ 水浴lh。f）洗板：用洗涤液II洗三次，操作同上。g）加酶标记兔抗鼠Ig复合物：先在酶标记兔抗鼠Ig复合物管中加0.5mL稀释液混匀后全部吸出于3.6mL稀释液中混匀，每孔加100ul, 37℃水浴lh。h）洗板：用洗涤液II洗三次，操作同上．i）诊酶底物反应：每孔（包括第一孔）各加基质液100ul，室温下避光5min——10min，再加人终止液50ul。j）结果判定：以酶标仪在波长492nm下测定吸光度（OD）值，计算见式（1):
吸光度=（阴性对照OD值-待测样本OD值）*100%/阴性对照OD值
吸光度二吸光度大于等于50％为阳性，目测无色或明显淡于阴性对照为阳性。
6.5.2双向琼脂扩散试验检测LT   将被检菌株按五点环形接种于Elek氏培养基上。以同样操作，共做两份，于36℃培养48h。在每株菌的菌苔上放多粘菌素B纸片，于36℃ 经5h～6h，使肠毒素渗人琼脂中，在五点环形菌苔各5mm处的中央，挖一个直径4mm的圆孔，并用一滴琼脂垫底。在平板的中央孔内滴加LT抗毒素30ul，用已知产LT和不产毒菌株作对照，于36℃经15h一20h观察结果。在菌斑和抗毒素孔之间出现白色沉淀带者为阳性，无沉淀带者为阴性。6.5.3乳鼠灌胃试验检测ST  将被检菌株接种于Honda氏产毒肉汤内，子36℃ 培养24h，以3000r／min离心30min，取上清液经薄膜滤器过滤，加热60℃30min，每1mL滤液内加人2％伊文思蓝溶液0.02mL。将此滤液用塑料小管注人1日一4日龄的乳鼠胃内0.1mL，同时接种3只～4只，禁食3h～4h后用三氯甲烷麻醉，取出全部肠管，称量肠管（包括积液）重量及剩余体重。肠管重量与剩余体重之比大于0.09为阳性，0.07——0.09为可疑。6.6结果报告综合以上生化试验、血清学试验、肠毒素试验作出报告。   
   

 

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