中华人民共和国进出口商品检验行业标准 出口食品中蜡样芽孢杆菌——3

7　证实试验
7.1　形态观察取营养琼脂斜面培养物,作革兰氏染色镜检。蜡样芽孢杆菌为革兰氏阳性大杆菌,呈短链或长链,芽孢呈椭圆形位于菌体中央或偏端,不使菌体胀大。
7.2　生化学性状
7.2.1　葡萄糖发酵试验　　
  接种于酚红葡萄糖肉汤中,厌氧条件下35℃培养24h。培养基应由红色变为黄色(表明本菌在厌氧条件下分解葡萄糖产酸)。
7.2.2　硝酸盐还原试验　　
  接种于硝酸盐肉汤中,35℃培养24h。加硝酸盐试剂后应为阳性反应(红色)。
7.2.3 V-P试验　　
  接种于改良V-P培养基中,35℃培养48 h。加V-P试剂及肌酸数粒,静止1h,应为阳性反应(伊红色)。
7.2.4　L-酪氨酸分解试验　　
   接种于L-酪氨酸琼脂培养基上,35℃培养48 h,阳性反应菌落周围培养基应出现澄清透明区(表示产生酪蛋白酶)。阴性时应继续培养72 h再观察。
7.2.5　溶菌酶试验　　
   用直径2mm接种环取纯菌悬液一环,接种于溶菌酶肉汤中,35℃培养24h。该菌在本培养基(含0.001％的溶菌酶)中能生长。如出现阴性反应,应继续培养24 h。
7.2.6　卵磷脂酶试验　　接种于MYP琼脂平板上,35℃培养24 h。阳性反应菌落周围应出现沉淀环(表示产生卵磷脂酶)。
7.3　蜡样芽孢杆菌与类似菌的鉴别试验
7.3.1　动力试验　
　用接种针挑取培养物穿刺接种于动力培养基中,30℃培养24h。有动力蜡样芽孢杆菌应沿穿刺线呈扩散生长,而蕈状芽孢杆菌常常呈绒毛状生长,形成所谓的蜂巢状扩散。也可用悬滴法检查。蜡样芽孢杆菌和苏云金芽孢杆菌通常运动极为活泼,而炭疽杆菌则不运动。7.3.2　根状生长试验　
　用接种环取培养物接种于营养琼脂平板上,30℃培养18～24h。蜡样芽孢杆菌群的多数菌株形成粗糙的似毛玻璃状或融蜡状的菌落。其中唯独蕈状芽孢杆菌则形成根状生长的特征。
7.3.3　溶血试验　
　取培养物接种于胰酪胨大豆羊血琼脂平板上,30～32℃培养24h。蜡样芽孢杆菌落周围呈现β型完全溶血的溶血环。苏云金芽孢杆菌和蕈状芽孢杆菌呈现弱的溶血现象,而炭疽芽孢杆菌通常为不溶血。
7.3.4　蛋白质结晶毒素试验　
　取经30℃培养24h并于室温放置2～3d的营养琼脂培养物少许于载玻片上,滴加蒸馏水混涂成薄膜。经自然干燥,微火固定后,于涂膜加甲醇半分钟后倾掉,再通过火焰干燥,于载片上滴满0.5％碱性复红液,放火焰上加热微见蒸气(勿使染液沸腾)后持续1.5min,移去火焰,使载片放置0.5min再倾去染液。用洁净自来水彻底清洗、晾干、镜检。观察有无游离芽孢和染成黑色的菱形毒素结晶体。如发现游离芽孢形成的不丰富,应将培养物置室温2～3d再行检查。苏云金芽孢杆菌用此法检测为阳性,而蜡样芽孢杆菌群的其他菌种则为阴性。
7.3.5　结果解释及报告　
　符合蜡样芽孢杆菌群的特征,有活泼的动力,很强的溶血能力,不形成根状生长和不产生蛋白结晶毒素,可报告为蜡样芽孢杆菌。　
　对偶尔遇到的一些少数可疑菌株,可以根据需要进行其他试验,如青霉素酶、噬菌体试验等。   
   

 

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