乳酸杆菌分离鉴定技术研究进展——3

2.2.2.3  PCR一变性梯度凝胶电泳 (PCR．denaturing  g radient gelelectmphoresis。PCR．DGGE)PCR．DGG最初被用来监测基因突变。 后来被广泛的应用于微生物研究，目前国外已将该技术已广泛用于食品中乳酸杆菌菌株的筛选、分组、鉴定以及对食品品质评估 和质量控制。TABASCO等2007年用PCR．DGGE技术成功的将发酵奶制品中的保加利亚乳酸杆菌、嗜酸乳酸杆菌、类干酪乳酸杆菌、双歧杆菌、嗜热链球菌等进行了鉴别， FONTAN等也用同样的技术将真空包装牛肉中的清酒乳酸杆菌、弯曲乳酸杆菌、 冷明串珠菌区分出来。由于PCR．DGGE可以区分含碱基成分不同而片段大小一致的DN A序列，甚至一个碱基对的不同都会引起DN A片段停留于凝胶的位置各异，所以与传统乳酸杆菌的鉴定技术相 比，具有快速、全面的特点。同时DGGE技术也有其限制性，主要表现在：① 只能分离较小的片段(最长达1 0 0 0 b p) ，因此提供的信息有限，片段太长时解离率下降。②DGG在种水平上鉴定细菌菌群结构有限。③依据16S r DNA的DGGE研究菌群多样性，由于某些种类16 Sr DNA的拷贝之间的异质性问题及异源核酸双链分子的检出可能会导致自然菌群 中细菌数量的过多估计。  
2.2.2.4 多重PCR( multiplex PCR) 由于乳酸杆菌种类繁多，菌群组成复杂， 因此传统的PCR方法难以达到多种乳酸杆菌快速同时鉴定的目的， 这一不足可以通过在单一反应中同时扩增多个位点的多重PCR预以弥补。由于多重PCR同时扩增多个目的基因，具有节省时间、 降低成本、提高效率的优点，所以一经提出即得到研究者的青睐，并且发展迅速，现已成为乳 酸杆菌分类鉴定的一项成熟而重要的研究手段。已有学者利用这项技术同时将嗜酸乳酸杆菌、干酪乳酸杆菌、德氏乳酸杆菌、 瑞士乳酸杆菌、 鼠李糖乳酸杆菌、 植物乳酸杆菌区 
分开来。其它一些乳酸杆菌如短乳酸杆菌、发酵乳酸杆菌、 希氏乳酸杆菌、 食果糖乳酸杆 菌等都可以应用多重PCR方法进行一次性鉴别。该技术的难点在于引物的设计和PCR扩增条件的标准化等，此外，对操作者技术要求较高并且多重PCR的结果特异性较差。
2.2.2.4 多重PCR(multiplex  PCR)由于乳酸杆菌种类繁多，菌群组成复杂， 因此传统的P CR方法难以达到多种乳酸杆菌快速同时鉴定的目的，这一不足可以通过在单一反应中同时扩增 多个位点的多重PCR预以弥补。由于多重PCR同时扩增多个目的基因，具有节省时间、降低成本、提高效率的优点，所以一经提出即得到研究者的青睐，并且发展迅速，现已成为乳 酸杆菌分类鉴定的一项成熟而重要的研究手段。已有学者利用这项技术同时将嗜酸乳酸杆菌、干酪乳酸杆菌、德氏乳酸杆菌、 瑞士乳酸杆菌、 鼠李糖乳酸杆菌、 植物乳酸杆菌区 
分开来。其它一些乳酸杆菌如短乳酸杆菌、发酵乳酸杆菌、希氏乳酸杆菌、食果糖乳酸杆菌等都可以应用多重PCR方法进行一次性鉴别。该技术的难点在于引物的设计和PCR扩增条件的标准化等，此外，对操作者技术要求较高并且多重PCR的结果特异性较差。  
3 展望 
  由于乳酸杆菌对人体的作用存在株的差异，同一种内不同株间其功能和特性各异，因此对 于乳酸杆菌种株水平鉴定技术的研究已成为国内外研究的焦点，也是确保含有乳酸杆菌食品安全性的重要保障。目前，各种核酸技术在乳酸杆菌鉴定中的应用都还处于探索性阶段且各有优缺点，PCR方法只能够对一部分乳酸杆菌进行鉴别，PFGE分型方法中仍然存在着不能被鉴定的同源性菌株，未来的研究中发展和完善现有的核酸分型技术，创建更新更完备的分 型鉴定方法将是各国学者潜心研究的重点。目前，基因芯片技术发展迅速，并越来越多的应用于微生物的分型和鉴定，在各种核酸分型鉴定技术成熟稳定后，建立乳酸杆菌的基因芯片技术将指日可待。   
   

 

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