我国行业标准-出口食品中霍乱弧菌检验方法——1

6、检验步骤_检验步骤见图所示.(略)
6.1增菌
   称取检样25g，加入装有225mL碱性蛋白胨水（APW）的广口瓶内。固体样品应以均质器9000r/min~10000r/min打碎，或以剪刀充分剪碎。（36±1）℃培养6h~8h和16h~24h。
   如为牡蛎样品，应同样制备另一份检样，置于APW中，42℃培养6h~8h和16h~24h。
6.2分离
   以3mm~5mm接种环取6h~8h和16h~24h增菌培养液的表面生长物一环分别划线家终于TCBS琼脂平板至少各一个，于（36±1）℃培养18~24h。
   在TCBS琼脂上，典型的霍乱弧菌菌落为大的，光滑，黄色，稍平，具有不透明中心和半透明的边缘。
6.3初步鉴定
6.3.1用接种环挑取TCBS琼脂平板上2~5个可疑菌落，划线于T1N1琼脂平板上，（36±1）℃培养12h~18h。
6.3.2以无菌白色滤纸沾取T1N1琼脂表面培养物，滴加氧化酶试剂进行氧化酶试验。
6.3.3以无菌环取氧化酶阳性的培养物于0.5%去氧胆酸钠液试剂滴中，进行粘丝试验。
6.3.4以接种针取氧化酶和粘丝试验阳性的培养物，接种TSI、KIA和AGS，穿刺底层并划线斜面。
6.3.5以接种针取上项相同培养物接种T1N0和T1N3肉汤。
6.3.6将TSI、KIA、AGS、T1N0和T1N3肉汤于（36±1）℃培养18h~24h。
表1 霍乱弧菌与相关细菌在初步鉴定试验中的反应

                KIA TSI AGS T1N0 T1N3
             斜面 底层 斜面  底层 斜面 底层
霍乱弧菌      K    A  A(K少见)A    K    a      +         +
拟态弧菌      K    A  K(A少见)A    K    A      +         +
副溶血性弧菌  K    A    K     A    K    A      -         +
溶藻弧菌      K    A    A     A    K    A      -         +
创伤弧菌     K或A  A K(A少见) A    K    A      -         +
嗜水气单胞菌 K或A  A  K或A    A    K    K      +         -
类志贺邻单胞菌K或A A  K或A    A   ND   ND  +         -
注：K—碱性；A—酸性；a—微酸性；ND—未鉴定。
    弧菌属细菌在TSI、KIA、AGS中不产生H2S,也不产气。一些契单胞菌属菌株可能产气。
6.4 确认试验
    以接种环取初步鉴定试验符合霍乱弧菌反应的T1N3培养物，分别接种到以下培养基：
    Hugh—Leifson葡萄糖肉汤(HLGB)，（36±1）℃培养18h~24h。
    ONPG胨水，（36±1）℃培养，1h~3h或24h。
    赖氨酸脱羧酶肉汤，（36±1）℃培养24h~96h。
    阿拉伯糖肉汤，（36±1）℃培养24h。
    O/129试验用培养基，（36±1）℃培养18h~24h。
                表2   霍乱弧菌的生化性状
    生化项目 生化性状      生化项目 生化性状
     TCBS            Y          D－甘露醇        ＋
      AGS           Ka            氧化酶         ＋
   NaCl  0％         ＋            ONPG          ＋
3％         ＋           V－P           v
6％         －         精氨酸双水解酶   －
8％         －         赖氨酸脱羧酶     ＋
10％        －         鸟氨酸脱羧酶     ＋
     42℃生长        ＋           抑菌试验       
      蔗糖           －           10μgO/129      S
   D-纤维二糖        －           150μgO/129     S 
     乳糖            －            明胶酶        ＋
   阿拉伯糖          －            尿素酶        －
  D－甘露糖    ＋
注：Y－黄色；K－碱性；a－微酸性；＋－80％或更多的菌株阳性；v－依据种或菌株的可变反应；S－敏感；AGS－精氨酸-葡萄糖斜面。
    所有试验均不产硫化氢和气体。    
      
   

 

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