我国进出口检验行业标准-副溶血性弧菌检验方法——4

9.7　胰胨大豆琼脂斜面(TSA)　　
胰　胨 　　　15.0g　　
植物蛋白胨 　5.0g　　
氯化钠　　　 30.0g　　
琼　脂 　　　15.0g　　
蒸馏水 1000mL　　
  将各成分加入水中,要不断搅拌,加热至煮沸1min。分装于15mm×150mm试管,每管  3mL。121℃高压灭菌15min后制成斜面,最终pH7.3±0.2。 　
试剂:　10g/L盐酸四甲基对苯二胺水溶液　　　　　10g/Lα-萘酚乙醇溶液　　　　　 
  将配好后的10g/L盐酸四甲基对苯二胺溶液置于密塞棕色玻璃瓶中,于5～10℃存放。此试剂极易氧化,宜现用现配。试验时,取37℃18～24h的胰胨大豆琼脂斜面培养物1支。将两种试剂各2～3滴从斜面上端流下,2min内呈现蓝色者为细胞色素氧化酶试验阳性。 
9.8　靛基质试验用培养基(I)　　培养基同9.6的30g/L氯化钠胰胨水。　　
靛基质试剂〔柯凡克(KOVAS)氏试剂〕:　　
对二甲氨基苯甲醛 10.0g 　　
纯戊醇 　　150.0mL 　　
浓盐酸　　 60.0mL 　　
  将试剂溶于戊醇中,然后慢慢加盐酸,加热至60℃后,呈深黄色,静置6～7h,变成黄色即可使用。试液宜小量配制,冰箱保存。久存后,试液变为黄褐色,不可继续使用。　　
在30g/L氯化钠胰胨水18～24h培养液中,滴加柯凡克试液0.1mL。出现红色环者为阳性,出现黄棕色环者为阴性。 
9.9　氨基酸试验用培养基 
9.9.1　赖氨酸脱羧酶培养基(LD)　　
酵母浸膏　 3.0g　　
葡萄糖　　 1.0g　　
氯化钠 　　30.0g　　
L-赖氨酸　  5.0g　　
溴甲酚紫　 0.016g　　
蒸馏水　　 1000mL 　　
  除溴甲酚紫外,将各成分加入蒸馏水中,搅拌均匀,静置约10min,加热至完全溶解,调至pH6.7±0.1。分装于10mm×100mm试管,每管1mL。121℃高压灭菌10min。灭菌后应立即取出放凉,接种培养后,培养基颜色变为深紫色的为阳性反应,变为黄色的,为阴性反应。 
9.9.2　精氨酸双水解酶试验用培养基(AD)　　基础培养基同赖氨酸脱羧酶试验用培养基,精氨酸加入量同赖氨酸量。
9.10 V-P半固体琼脂(VP) 　　
酵母浸膏　 1.0g　　
蛋白胨 12.0g　　
葡萄糖 10.0g　　
氯化钠 30.0g　　
琼　脂 3.0g　　
蒸馏水 1000mL 　　
  将各成分加入蒸馏水中,静置约10 min,搅拌、加热至溶解。调pH7.3±0.1,分装于  10mm×100mm试管,每管1mL,121℃高压灭菌10min。灭菌后,立即取出放凉。　　
V-P试剂:　　
甲液:α-萘粉　 6.0g　　　　　
纯乙醇  100.0mL　　
乙液:氢氧化钾 40.0g　　　　　
肌　酸　 0.3g　 　　　　
蒸馏水 100.0mL 　　
  先将氢氧化钾溶于水中,再加入肌酸。　　
以上试剂保存于冰箱中,可使用两个月。试验时,分别加甲液0.2mL(约6滴)和乙液  0.1mL(约3滴)。加入试剂后呈现红色者为阳性,铜色为阴性。对阴性结果1h后再做一次检查。9.11 糖类分解试验用培养基　　
蛋白胨 　　10.0g 　　
牛肉浸膏　 3.0g　　
氯化钠 　　30.0g　　
溴甲酚紫　 0.04g　　
蒸馏水　　 1000mL 　　
  除溴甲酚紫外,将各成分加热溶解,按1％量加入糖类。调至pH7.0±0.2,加入溴甲酚紫。分装于10mm×100mm试管,每管1mL,112℃高压灭菌15min。 
9.12 42℃生长试验用培养基　　
胰　胨 　　　17.0g　　
大豆胨　　　 3.0g　　
氯化钠 　　　30.0g　　
磷酸氢二钾　 2.5g　　
葡萄糖　　　  2.5g　　
蒸馏水 　　　1000mL 　　
  除葡萄糖外,将各种成分混合溶解,煮沸1～2min,加入葡萄糖。调至pH7.3±0.2。分装于15mm×150mm试管,每管7mL,121℃高压灭菌15min。 
9.13 O/F试验用培养基(HLGB)　　
蛋白胨　　 2.0g　　
酵母浸膏　 0.5g　　
氯化钠 　　30.0g　　
葡萄糖 　　10.0g　　
溴甲酚紫　  0.015g　　
琼　脂 　　3.0g　　
蒸馏水　　 1000mL　　
  将各成分(除溴甲酚紫外)加于蒸馏水中加热溶解,调至pH7.4,加入溴甲酚紫,混匀,  分装于15mm×150mm试管,每管3mL,121℃高压灭菌15min。 　 　　
  本培养基用于鉴别革兰氏阴性细菌对于葡萄糖的发酵型和氧化型代谢作用。将同一菌株接种于2 支该培养基中,其中一支管的培养基上面加灭菌矿物油脂来隔离氧气,而另一支管不加。这样发酵型细菌在两管培养基中均产生酸性反应,氧化型细菌则在未加矿物油脂的管中产生酸性反应,而在加油脂的培养管中只有轻度或者不生长也无反应变化。 
9.14 神奈川现象试验用我妻氏琼脂(WA)　　
酵母浸膏　　 3.0g　　
蛋白胨 　　　10.0g　　
氯化钠 　　　70.0g　　
磷酸氢二钾　 5.0g　　
甘露醇 　　　 10.0g　　
结晶紫　　　　0.001g　　
琼　脂 　　　15.0g　　
蒸馏水 　　　1000mL　　
  调至pH8.0(不必高压),加热30min,待冷至50℃,按5％的体积轻轻加入事先准备好的以生理盐水洗三次的新鲜人或兔血球。混合均匀倾注平皿,充分干燥后使用 。　　
注:新制备的培养基均应用已知阳性及阴性菌进行测试,以保证培养基质量。　　
如要求一定量样品中不得有副溶血性弧菌,则可将样品接种于9倍量的60g/L氯化钠蛋白胨水(前增菌)或多粘菌素B肉汤(直接增菌),以下操作按上列程序进行。    
   

 

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