我国行业标准-出口食品中霍乱弧菌检验方法——1,1

   7.1 自分离培养基上挑取可疑菌落与O1群及O139群霍乱弧菌诊断血清做玻片凝集试验。如可疑菌落在诊断血清中很快（一般在10s内）出现肉眼可见的明显凝集，在生理盐水中不凝集者判断为阳性。
7.2 O1群多价血清阳性的霍乱弧菌可进一步用小川型、稻叶型的单价抗血清分型。
7.2..1 在小川型单价血清凝集，在稻叶型单价血清不凝集者为小川型。
7.2.2在小川型单价血清凝集，在稻叶型单价血清不凝集者为小川型。
7.2.3在小川型、稻叶型单价血清均呈明显凝集者为彦岛型。
7.3 与O1群或O139群霍乱弧菌诊断血清及生理盐水均不凝集者为非O1群霍乱弧菌。
7.4 与O1群霍乱弧菌多价血清或O139群霍乱弧菌诊断血清及生理盐水均凝集的，可用胰胨水大豆琼脂或脑心浸液琼脂传代，再进行凝集试验。
7.5 对玻片凝集反应不典型的菌株应做试管凝集试验。
   用生理盐水自1：20开始对倍连续稀释O1群霍乱弧菌多价血清，每管含稀释血清0.5mL。将被检菌在营养琼脂的16h～18h培养物用0.2％甲醛生理盐水制成每毫升约含18亿菌体（相当于细菌标准比浊管浓度）的悬液，每稀释血清管加入0.5mL；另将菌悬液0.5mL加入0.5mL生理盐水中作为对照。摇匀，置37℃3h观察初步结果。再放4℃或室温过夜，观察最后结果：生理盐水对照不出现自然凝集，能使菌凝于管底成伞状，上清半透明判为＋＋；能使试验菌出现＋－凝集的血清最高稀释倍数为凝集滴度。凝集滴度达到或超过血清原效价一半即确定为O1群霍乱弧菌。
8、古典型与埃尔托型霍乱弧菌的鉴别
8.1 多粘菌素B敏感试验
8.1.1在胰酪胨大豆胨琼脂平板背面用玻璃笔划出若干方格。
8.1.2将被检菌（36±1）℃4h肉汤培养物划线平板表面，待干后镊取50单位多粘菌素B纸片置于接种区中央，倒置平板，（36±1）℃培养过夜。
    古典型菌株在纸片周围呈现抑制带（10mm～15mm直径），而埃尔托型菌株不受抑制或轻微抑制（7mm直径）。
8.2溶血试验
8.2.1将24h培养物和5％红细胞盐水悬浮液等量混合（0.5mL或1mL）。
8.2.2将上项部分混合液在56℃加热30min做对照。
8.2.3将混合物在（36±1）℃水溶液中培养2h，再在（4～5）℃下冷藏过夜。
8.2.4检查溶血现象，必要时可低速离心后再检查有无溶血现象。
     多数埃尔托型菌株会造成红血球溶解，古典型及某些埃尔托型菌株不溶解红血球，由于溶血素不耐热，加过热的培养物不会产生溶血。
8.3加试剂观察结果。
   埃尔托型V-P试验
8.3.1接种MR-VP肉汤，22℃培养18h～24h。
8.3.2滴菌株通常为阳性，古典型菌株通常为阴性。
9、报告结果
霍乱弧菌的检出，可依据以下性状报告：
革兰氏染色阴性，无芽孢或弯曲杆菌；
TSI：斜面产酸，底层产酸，不产气，不产硫化氢（H2S）；
Hugh-Leifson试验：葡萄糖发酵阳性；
氧化酶：阳性；
精氨酸脱羧酶试验：阴性；
赖氨酸脱羧酶试验：阳性；
V-P试验：埃尔托生物型阳性，古典生物型阴性；
42℃生长：阳性；
嗜盐性试验：0％NaCl＋（有的非O1群霍乱弧菌不生长）
  3％NaCl＋
  6％NaCl－
  蔗糖发酵：阳性；
  ONPG试验：阳性；
  阿拉伯糖发酵：阴性；
  O129抑菌试验：10μg敏感；150μg敏感；
血清学试验：O1群（稻叶型、小川型、彦岛型）、O139群、非O1群。
最终结果的报告，应在生化试验的基础上报告血清型别和生物型别。
如有明确规定，仅需检验O1、O139群霍乱弧菌时，可直接对可疑菌株进行血清学凝集试验进行初步鉴定。
检出O1、O139及非O1群霍乱弧菌的，要在24h内呈报到上一级实验室做进一步鉴定或复查，并报告国家出入境检验检疫局。   
   
   

 

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