食品卫生微生物学检验沙门氏菌检验2——GB

6.操作步骤
6.1前增菌和增菌冻肉、蛋品、乳品及其他加工食品均应经过前增菌。以无菌操作取器g(mL)，加在装有225mL缓冲蛋白陈水的500mL广口瓶内。固体食品可先应用均质器以8000r/min——10000r／min,或用乳钵加灭菌砂磨碎，粉状食品用灭菌匙或玻棒研磨使乳化，于36℃士1℃培养4h（干蛋品培养18h——24h)，移取10mL，转种于100mL氯化镁孔雀绿增菌液或四硫酸钠煌绿增菌液内，于42℃培养18h——24h。同时，另取10mL，转种于100mL亚硒酸盐胧氨酸增菌液内，于36℃士1℃培养18h——24h。鲜肉、鲜蛋、鲜乳或其他未经加工的食品不必经过前增菌。各取25g〔25mL）加人灭菌生理盐水25mL，按前法做成检样匀液；取25mL，接种于100mL氯化镁孔雀绿增菌掖或四硫磺酸钠煌绿增菌液内，于42℃培养24h；另取25mL接种于100mL亚硒酸盐胧氨酸增菌液内，于36℃士1℃培养18h——24h。
6.2分离取增菌液1环，划线接种于一个亚硫酸秘琼脂平板和一个DHL琼脂平板（或HE琼脂平板、WS或SS琼脂平板）。两种增菌液可同时划线接种在同一个平板上。于36℃士1℃分别培养18h——24h(DHL、HE、WS、SS）或4oh——48h(BS)，观察各个平板上生长的菌落，沙门氏菌I、II、IV、V、VI和沙门氏菌皿在各个平板上的菌落特征见表l。
6.3生化试验
6.3.1自选择性琼脂平板上直接挑取数个可疑菌落，分别接种三糖铁琼脂。在三糖铁琼脂内。
6.3.2在接种三糖铁琼脂的同时，再接种蛋白膝水（供做靛基质试验）、尿素琼脂（pH7.2）、氰化钾(KCN）培养基和赖氨酸脱叛酶试验培养基及对照培养藻各一管，于36℃士1℃培养18h～24h，必要时可延长至48h，按表3判定结果。按反应序号分类，沙门氏菌属的结果应属于Al、AZ和B1，其他5种反应结果均可以排除。
6.3.2.1反应序号Al：典型反应判定为沙门氏菌属。如尿素、氰化钾和赖氨酸三项中有一项异常，按表4可判定为沙门氏菌。如有两项异常，则按A3判定为弗劳地氏柠檬酸杆菌。6.3.2.2反应序号AZ：补做甘露醇和山梨醇试验，按表5判定结果。
6.3.2.3反应序号Bl：补做ONPG。ONPG＋为大肠埃希氏菌，ONPG一为抄门氏菌。同时，沙门氏菌应为赖氨酸＋，但甲型副伤寒沙门氏菌为赖氨酸一。
6.3.2.4必要时按表6进行沙门氏菌生化群的鉴别。
6.4血清学分型鉴定
6.4.1抗原的准备一般采用1.5％琼脂斜面培养物作为玻片凝集试验用的抗原。O血清不凝集时，将菌株接种在琼脂量较高的〔如2.5％一3%）培养基上再检查；如果是由于vi抗原的存在而阻止了O凝集反应时，可挑取菌苔于1mL生理盐水中做成浓菌液，于酒精灯火焰上煮沸后再检查。H抗原发育不良时，将菌株接在0.7%——0.8％半固体琼脂平板的中央，侠菌落蔓延生长时，在其边缘部分取菌检查；或将菌株通过装有0.3%～0.4％半固体琼脂的小玻管1次一2次，自远端取菌培养后再检查。
6.4.2 0抗原的鉴定用A——F多价。血清做玻片蔓集试验，同时用生理盐水做对照。在生理盐水中自凝者为粗糙形菌株，不能分型。被A——F多价O血清凝集者，依次用04;03、10；07;08;09;02和011因子血清做凝集试验。根据试验结果，判定O群。被03、10。血清凝集的菌株，再用010、015、O34、019单因子血清做凝集试验，根据试验结果，判定O群...被03、10血清凝集的菌株，再用010、015、034、019单因子血清做凝集试验，判定El、EZ、E3、E4各亚群，每一个O抗原成分的最后确定均应根据0单因子血清的检查结果，没有O单因子血清的要用两个O复合因子血清进行核对．不被A——F多价O血清凝集者，先用57种或163种沙门氏菌因子血清中的9种多价0血清检查，如有其中一种血清凝集，则用这种血清所包括的O群血清逐一检查，以确定O群。每种多价O血清所包括的O因子如下：O多价1 A,B,C,D,E,F群（并包括6,14群）0多价2 13,16,17,18,21群O多价3 28,30,35,38,39群O多价4 40,41,42,43群O多价5 44,45,47,48群O多价6 50,51,52,53群O多价7 55,56，弓7,58群O多价8 59,60,61,62群O多价9 63,65,66,67群6.4.3 H抗原的鉴定不常见的菌型，先用163种沙门氏菌因子血清中的8种多价H血清检查，如有其中一种或两种血清凝集．则再用这一种或两种血清所包括的各种H因子血清逐一检查，以确定第1相和第2相的H抗原。8种多价H血清所包括的H因子如下：H多价l a,b,c,d,iH多价2 eh,enx,enz15，fg,gms,gpu,gp,gq,mt,gz51H多价3 k,r,y,z,z10，Iv,lw,lz13,lz28，lz40
H多价4 1,2;1,5;1,6;l,7；z6
H多价5 z4z23；z4z24；z4z32；z29，z35，z36，z38。H多价6：z39，z41,z42,z44
H多价7 z32，z53,z54，z55H多价8 z56，z57,z60,z61，z62每一个H抗原成分的最后确定均应根据H单因子血清的检查结果，没有H单因子血清的要用两个H复合因子血清进行核对。检出第1相H抗原而未检出第z相H抗原的或检出第2相H抗原而未检出第1相H抗原的，可在琼脂斜面上移种1代～2代后再检查。如仍只检出一个相的H抗原，要用位相变异的方法检查其另一个相。单相菌不必做位相变异检查。位相变异试验方法如下：小玻管法：将半固体管（每管约1mL——2ml）在酒精灯上溶化并冷至50℃，取已知相的H因子血清0.05mL～0.lmL，加人于溶化的半周体内，混匀后，用毛细吸管吸取分装于供位相变异试验的小玻管内，俊凝固后，用接种针挑取待检菌，接种子一端。将小玻管平放在平皿内，并在其旁放一团湿棉花，以防琼脂中水分蒸发而干缩，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可以从另一端挑取细菌进行检查。培养墓内血清的浓度应有适当的比例，过高时细菌不能生长，过低时同一相细菌的动力不能抑制。一般按原血清l:200～1：800的量加人。小倒管法：将两端开口的小玻管（下端开口要留一个缺口，不要平齐）放在半固体管内，小玻管的上端应高出于培养基的表面，灭菌后备用。临用时在酒精灯上加热溶化，冷至50℃，挑取因子血清1环，加入小套管中的半固体内，略加搅动，使其混匀，佼凝固后，将待检菌株接种于小套管中的半固体表层内，每天检查结果，待另一相细菌解离后，可从套管外的半固体表面取菌检查，或转种1％软琼脂斜面，于37℃培养后再做凝集试验。简易平板法：将0.7%～0.8％半固体琼脂平板烘干表面水分，挑取因子血清1环，滴在半固体平板表面，放置片刻，待血清吸收到琼脂内，在血清部位的中央点种待检菌株，培养后，在形成蔓延生长的菌苔边缘取菌检查。
6.4.4 VI抗原的鉴定用vi因子血清检查。已知具有Vi抗原的菌型有：伤寒沙门氏菌，丙型副伤寒沙门氏菌，都柏林沙门氏菌。6.5菌型的判定和结果报告综合以上生化试验和血清学分型鉴定的结果，按照表7或有关沙门氏菌属抗原表判定菌型，并报告结果。   
   

 

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