食品卫生微生物学检验空肠弯曲菌检验2——GB

6.操作步骤
6.1样品的采集及处理食物样品采集后应尽快进行检验。如果样品必须运送和保存，应使用Cary一Blair半固体培养基。弯曲菌的存活时间取决于温度，在25℃情况下，其存活时间不到24h或更短，因此样品在原始分离前需放冰箱或冷处保存。
6.2微需氧条件的制备最佳微需氧条件是氧气为5％、二氧化碳为10％、氢气为85％。
6.2.1带有双相压力计（可表示正负压的）厌氧罐：在装皿密封后，先抽去罐内空气至负压7300Pa( 550mmHg）处，输人上述三种混合气体使罐内压力恢复于零；再将罐内气体抽至负压7300Pa( 550mmHg）同样输人上述气体至零，即可放置温箱培养。
6.2.2气袋法：操作时只使用气体发生剂而不加催化剂。
6.2.3双平板法：取两块平板，一块平板接种已知的兼性厌氧菌（如变形杆菌），另一块平板接种样品，去掉皿盖，将含琼脂的两只皿相对合齐并用胶布粘封，放人密封不漏气的罐内（或袋内）进行培养。由于兼性厌氧菌生长的代谢作用，可使小环境中的氧气浓度下降和二氧化碳浓度上升。
6.2.4蜡烛缸法：将已接种细菌的平板置于容量2000mL的磨口标本缸或千燥器内。缸盖及缸口涂以凡士林，放人小段点燃蜡烛于缸内（勿靠近缸壁，以免烤热缸壁而炸裂），盖密缸盖。缸内燃烛约0.5——1min，因氧减少自行熄灭，此时容器内约含二氧化碳5％——10%。最后连同容器一并置于42℃士1℃ 箱中培养。
6.3分离培养
6.3.1拭子或液体可直接在选择性培养基如改良Camp一BAP布氏杆菌培养基或使用Skirrow氏培养基平板上划线接种。于42℃ 养48h后，观察可疑菌落。
6.3.2第一型菌落不溶血，灰色、扁平、湿润、有光泽，看上去像水滴，有从接种线向外扩散的倾向；第二型菌落也不溶血，常呈分散凸起的单个菌落（直径为1mm，边缘完整、发亮）。
6.4初步鉴定将可疑菌落做氧化酶和过氧化氢酶试验，如为阳性，则涂片做革兰氏染色。本菌为革兰氏明性菌，大小为（0.3um——0.4um）*（1.5um——3um），呈S形、螺旋状或纺锤形。在固体培养基上培养时间过久或在不适条件下则常呈现球形菌。在暗视野或相差显微镜下观察，动力明显。根据菌落生长特征、菌体染色、动力、氧化酶和过氧化氢酶试验阳性者，可初步确定为弯曲菌。
6.5确定鉴定经初步鉴定后，仍需做下述试验（以下各项试验均需在5％氧气的微需氧环境中培养）。
6.5.1甘氨酸耐受性试验：接种于甘氨酸培养基中，培养48h。如为阳性，在培养基表面有云雾状生长，则为弯曲菌空肠亚种。
6.5.2硫化氢生长试验：接种子T鱿斜面上，并吊一根乙酸铅滤纸条于管口，培养物经48h——72h培养，空肠弯曲菌一般在斜面上少量生长，其反应为碱性／碱性（K/K），滤纸条变黑，但培养基底部不因硫化氢而变黑。
6.5.3对3.5%氯化钠的耐受性试验：接种于3.5％含盐肉汤培养基，经48h培养，空肠弯曲菌不生长。
6.5.4  42℃和25℃生长试验：将培养物接种于两管布氏肉汤中，一管放于42℃ 一管放于25℃培养48h，42℃ 长而25℃不生长者，则为空肠弯曲菌。
6.5.5马尿酸钠水解试验：将培养物接种于马尿酸钠培养基，于42℃ 养48h，离心沉淀取出部分上清液。加入三氯化铁试剂，如出现恒久沉淀物则为阳性，空肠弯曲菌呈阳性反应。6.5.6萘啶酸试验：将可疑空肠弯曲菌涂布接种于血平板上，然后贴上含30ug萘啶酸的滤纸于平板上，空肠弯曲菌敏感而肠道弯曲菌不敏感．
6.5.7 TTC（2，3，5——氯化三苯四氮吐）试验：空肠弯曲菌在TTC培养基上里阳性，而胎儿弯曲菌为阴性，阳性者为紫色菌苔并有光泽。
6.5.8硝酸盐还原试验：取培养物的浓菌悬液，在37℃ 置2h，加人试剂，观察颜色反应，空肠弯曲菌星红色的阳性反应。6.5.9弯曲菌的生化鉴别见表工。
6.6生物分型
6.6.1快速马尿酸钠水解试验：将细菌接种在1％马尿酸钠0.4ml，37℃水浴2h，再加丙酮与丁酮溶液的3.5％茚三酮0.2ml，徐徐加入避免相混，放置10min观察结果。深紫色为阳性，淡紫色或无色为阴性。
6.6.2快速硫化氢试验，取一环细菌悬浮于快速硫化氢半固体琼脂上三分之一段，37℃水浴2h，观察结果，细菌团块周围变黑为阳性。
6.6.3 DNA酶水解试验：细菌点种于DNA酶甲基绿琼脂平板上，微需氧环境培养3d——5d，菌苔周围出现无色透明环为阳性。
6.7血清分型空肠弯曲O因子分型应采用间接血凝法，H或K因子分型可用玻片凝集法。
6.8菌种保存空肠弯曲菌菌种应接种在改良Camp-BAP斜面培养基上（棉塞不宜过紧），于42℃ 43℃ 需氧中培养48h后，置4℃ 箱微需氧内可保存10d～14d，需要时仍可转种一次，长期保存用冻干法。
6.9注意事项对空肠弯曲菌检验时，应严格执行无菌操作．防止自身感染。   
   

 

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