食品卫生微生物学检验金黄色葡萄球菌检验4——GB

A.3检验程序
A.3.1从菌株中检测肠毒素从菌株中检测肠毒素程序见图A.1（略）。
A.3.2从食物检样中提取和检测肠毒素
A.3.2.1微玻片法检测肠毒素（浓缩法和层析法）程序见图A.2（略）。
A.3.2.2酶联免疫法检测肠毒素程序见图A.3（略）。
A.4肠毒素检测
A.4.1从菌株中提取肠毒素方法
A.4.1.1液体透析培养法：用宽2.5cm、长80cm的透析袋装入60mL产毒培养基，两端扎紧，将透析袋装入250ml锥形瓶内，加人15mL灭菌生理盐水，透析袋两端留在瓶口，用棉塞塞好，121℃高压灭菌30min，待测菌株接种曹养琼脂斜面（试管18mm*180mm),37℃培养24h，用5mL生理盐水洗下菌落，倾人上述培养瓶中，每个菌种种一瓶，37℃振荡培养48h，振速为100次／min，吸出菌液离心，8000r/min3Omin，取上清液做双相琼脂扩散，如为阴性，再装入透析袋内，用电风扇吹，或用多聚乙二醇，浓缩至1mL-2mL，再做琼脂扩散。A.4.1.2固体透析培养法：向直径150mm的灭菌平皿或带盖搪瓷盘中倾人灭菌产毒培养基约100mL——120ml，凝固后表面铺一灭菌玻璃纸，待测菌株接种在营养琼脂上，37℃培养24h，用约3mL灭菌盐水洗下菌苔，倾在玻璃纸上，用灭菌三角棒涂满平皿，37℃培养48h，加人10mL——20mL灭菌生理盐水，用灭菌三角棒刮取菌苔，吸取菌液离心，以下步骤同液休透析培养法。
A.4.2从食品中提取肠毒素方法
A.4.2.1直接浓缩法：取食品样品100g，加入无菌0.2mol/L pHI7.5磷酸盐缓冲液，均质成匀浆，置4℃浸泡18h——24h，用纱布过滤将滤液离心8000r/min 20min．取上清液，放入分液漏斗中，加人10ml三氯甲烷，振摇10min，静置，将底层三氯甲烷弃去（如不分层，可8ooor/min离心20min）。加人6mol/l盐酸溶液调pH至4.5,8O00r／min离心20min，取上清液，加5mol/L氢氧化钠溶液，调pH至7.5，离心取上清液，装入透析袋或玻璃纸，用电扇吹干，或放多聚乙二醇浓缩至1mL——2mL，做微玻片双向琼脂扩散。
A.4.2.2层析法：如需提取较纯肠毒素，可将上述浓缩液用蒸馏水洗下，装入透析袋，以0.008mol/L pH5.6磷酸盐缓冲液平衡，加人CM层析柱内，流速lmL/min——2mL/min，用0.008mol/LpH5.6磷酸盐缓冲液洗脱，再用0.2mol/L pH6.8磷酸盐缓冲液洗脱出肠毒素。洗脱液装人透析袋内，用电扇或多聚乙二醇浓缩至1mL，做微玻片双向琼脂扩散，检测肠毒素。
A.4.3双向琼脂扩散检测肠毒素
A.4.3.1微玻片法：将在95％乙醇中浸泡的载片用洁净纱布擦千，吸取溶化的0.2％琼脂糖（蒸馏水配制）滴在载玻片上，使剩余的琼脂糖流下，放在无尘的环境中干燥，先将一层薄塑料板放在载玻片上，然后将带孔的有机玻璃模板边缘涂一层薄的硅胶或凡士林，放在塑料板上，两边用橡皮圈系紧固定，吸取1%琼脂糖，立即从模板中间孔加人载玻片和模板之间，直至充满琼脂糖，凝固后再将孔中琼脂糖用注射器针头挑去，在中间孔滴加抗血清，四周滴加菌株产毒液或食品提取液，放人加有湿棉球的容器内，放25℃一30℃、18h——24h观察结果。可在灯光上，并对着暗的背景观察，在抗血清和提取液之间呈现明显沉淀线。如沉淀线只能微弱可见时，可进行染色。
A.4.3.2玻片法：吸取溶化的1%琼脂糖2.5mL，铺在洁净载玻片上．凝固后用直径2.5mm的金属打孔器打成幅射型，孔距为2.5mm，中心孔加人肠毒素抗血清，周围六个孔加人菌株或食品的肠毒素提取液，放入有滴加2/10000三氮化钠湿棉球的容器内，以保持湿度。置25℃～30℃、18h-20h，观察结果，在抗血清的提取物之间有明显沉淀线即为阳性。
A.4.3.3染色法；用微玻片法取下胶带和有机玻璃摸板，玻片法可直接将玻片放人蒸馏水中浸泡4h-5h，中间换2次～3次水，在下述各液中浸10min，10％乙酸中含1％唾嚓红R（或氨基黑）；1％乙酸；1％乙酸含l％甘油，如脱色不净，可继续浸泡。取出后盖一滤纸，吸去多余液体，在室温或35℃烘干。阳性者沉淀被染上颜色，可长期保存．
A.4.4酶联免疫法检测肠毒素（双抗体法）
A.4.4.1包被抗体：用0.1m1/L pH9.5碳酸盐缓冲液稀释肠毒素抗血清使成5ug/mL，加人洗净的苯乙烯凹孔板内，每孔0.2mL，置36℃士1℃30min，弃去上液。
A.4.4.2洗涤：用0.05％ 0.02mol/L pH7.2吐温-20缓冲液洗涤五次。
A.4.4.3加人检样：如为液体，可直接加人0.2mL，固体样品取100g，加人0.2mol/LpH7.5磷酸盐缓冲液100ml，均质后取过滤液0.2mL。A.4.4.4洗涤：同A.4.4.2。
A.4.4.5每孔内加人酶抗体0.2ml，置36℃士1℃30min，同时做阳性和阴性对照。弃去上液。
A.4.4.6洗涤：同A.4.4.2.
A.4.4.7每孔内加人邻苯二胺酶底物溶液0.2mL，室温放置加而饥A.4.4.5每孔内加人2mol/L硫酸0.05mL，立即放酶标仪比色。
A.4.4.9结果判定：样品OD值比阴性对照，比值大于2为阳性，小于2为阴性。   
   

 

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