食品卫生微生物学检验肉毒梭菌及肉毒毒素检验2——GB

6、操作步骤
6.1肉毒毒素检测  
 液状检样可直接离心，固体或半流动检样须加适量（例如等量、倍量或5倍量、10倍量）明胶磷酸盐缓冲液，浸泡、研碎，然后离心，取上清液进行检测．另取一部分上清液，调pH6.2，每9份加10％胰酶（活力1：25的水溶液37℃作用60min，进行检测。肉毒毒素检测以小白鼠腹腔注射法为标准方法6.1.1检出试验：取上述离心上清液及其胰酶激活处理液分别注射小白鼠三只，每只0.5mL观察4d 注射液中若有肉毒毒素存在，小白鼠一般多在注射后24h发病、死亡。主要症状为竖毛、四胶瘫软，呼吸困难，呼吸呈风箱式，腰部凹陷，宛若蜂腰，最终死于呼吸麻痹。 
  遇小鼠拌死以至症状不明显时，则可将注射液做适当稀释，重做试验。
6.1.2 证试验：不论上清液或其胰酶激活处理液，凡能致小鼠发病、死亡者，取样分成三份进行试验，一份加等量多型混合肉毒抗毒诊断血清，混匀，37℃作用30min，一份加等量明胶磷酸盐缓冲液，混匀，煮沸10min，一份加等量明胶磷酸盆缓冲液，混匀即可，不做其他处理。三份混合液分别注射小白鼠各两只，每只0.5ml观察4d，若注射加诊断血清与煮沸加热的两份馄合液的小白鼠均获保护存活，而唯有注射米经其他处理的混合液的小白鼠以特有的症状死亡．则可判定检样中的肉毒毒素存在，必耍时要进行毒力测定及定型试验，6.1.3 力测定：取已判定含有肉毒毒素的检样离心上清液，用明胶磷酸盐缓冲液做成50、500 及500倍的稀释液，分别注射小白鼠各两只，每只0.5L观察4d 根据动物死亡情况，计算检样所含肉毒毒素的大体毒力（MLD/ml或MLD/g）例如：5、5倍及500稀释致动物全部死亡，而注射5 00稀释液的动物全部存活，则可大体判定检样上清液所含毒素的毒力为1000MLD/mL——10000MLD/mL 
6.1.4 型试验：按毒力测定结果，用明胶磷酸盐缓冲液将检样上清液稀释至所含毒索的毒力大体在10MLD/mL——1000MLD/mL范围，分别与各单型肉毒抗诊断血清等量混匀，37℃作用30min，各注射小鼠两只，每只0.5mL，观察4d。同时以明胶磷酸盐缓冲液代替诊断血清，与稀释毒素液等量馄合作为对照。能保护动物免于发病、死亡的诊断血清型即为检样所含肉毒毒素的型别。注1朱经胰酶激活处理的检样的毒素检出试验或确证试验若为阳性结果，则胰酶激活处理液可省略毒力测定及定型试验。
注2：为争取时间尽决得出结果毒素检测的各项试验也可同时进行。
注3：根据具体条件和可能性，定型试验可酌情先省略C、D、F及G型，
注4，进行确证及定型等中和试验时，检样的稀释应参照所用肉毒诊断血清的效价。
注5：试验动物的观察可按阳性结果的出现随时结束，以缩短观察时间；唯有出现阴性结果时，应保留充分的观察时间。
6.2肉毒梭菌检出（增菌产毒培养试验）取厄肉培养基三支，煮沸10min——15min，做如下处理：a）第一支：急速冷却，接种检样均质液1mL——2mL;b）第二支：冷却至60℃，接种检样，继续于60℃保温10min，急速冷却；c）第三支：接种检样，继续煮沸加热10min，急速冷却。以上接种物于30℃培养5d，若无生长，可再培养10d。培养到期，若有生长，取培养液离心，以其上清液进行毒素检测试验，方法同6.1，阳性结果证明检样中有肉毒梭菌存在。
6.3分离培养选取经毒素检测试验证实含有肉毒梭菌的前述增菌产毒培养物（必要时可重复一次适宜的加热处理）接种卵黄琼脂平板，35℃厌氧培养48h。肉毒梭菌在卵黄琼脂平板上生长时，菌落及周围培养基表面覆盖着特有的虹彩样（或珍珠您样）薄层，但G型菌无此现象。根据菌落形态及菌体形态挑取可疑菌落，接种应肉培养基，于30℃培养5d，进行毒素检测及培养特性检查确证试验。
6.3.1毒素检测：试验方法同6.1。
6.3.2培养特性检查：接种卵黄琼脂平板，分成两份，分别在35℃的需氧和厌氧条件下培养48h，观察生长情况及菌落形态。肉毒梭菌只有在厌氧条件下才能在卵黄琼脂平板上生长并形成具有上述特征的菌落，而在需氧条件下则不生长。注：为检出蜂蜜中存在的肉毒梭菌，蜂蜜检样需预温37℃（流质蜂蜜），或52℃～53℃（晶质蜂蜜）充分搅并后立即称取20g溶于100mL灭菌燕馏水（37℃或52℃～53℃），搅拌稀释，以8000r/min一10000r／min，离心30min(20℃），沉淀，加灭菌蒸馏水1mL，充分摇匀．等分各半，接种应肉培养基8ml——10ml各一支，分别在30℃及37℃下厌氧培养7d，按6.2进行肉毒毒素检测。   
   

 

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