脑源性神经营养因子brain2derivedneurotro2phicfactor,BDNF)作为神经生长因子家族成员,与神经系统发育有着密切关系,不仅对中枢神经元的发育、增殖分化、存活起重要作用,而且对损伤后神经元的修复与功能重塑也起重要作用。BDNF广泛分布于中枢及周围神经系统,以海马和皮质含量最高。研究表明BDNF可支持中脑多巴胺能神经元存活并向多巴胺能表型分化,并且能保护多巴胺能神经元免受62羟多巴胺62OHDA的神经毒素作用。还可通过支持胆碱能细胞的生存和上调胆碱乙酰转移酶的表达,增强神经系统的学习记忆作用;可减少钙离子内流、抗自由基损伤、抑制细胞凋亡等,从而保护神经元免受脑缺血缺氧的损伤。
由此可见,BDNF对多种中枢神经系统疾病如帕金森、痴呆及脑血管病等具有治疗潜能,然而如何将其透过血脑屏障运送至损伤的脑部,一直是十分困难的事情。1988年Green和Frankel各自独立发现HIV21病毒上的反式激活因子transactivator,TAT)能够进入细胞膜,具有蛋白转导作用Vives等研究发现TAT蛋白分子中与其在细胞内转导有关的是1段富含碱性氨基酸、带有较多正电荷的多肽片段核心序列由11个氨基酸即YGRKKRRQRRR组成。Schwarze等将TAT与相对分子质量为15～200×10Da的蛋白进行融合表达后,可介导这些蛋白从细胞外到细胞内的。直接跨膜转运。1999年Schwarze[9]研究发现TAT能携带蛋白质通过血脑屏障,积累到一定浓度并表现出蛋白活性。TAT具有速度快,不依赖于温度、能量、细胞膜抗体,对细胞没有损伤等特点,因此被认为是一种很有前途的运载工具。本研究通过克隆人BDNF基因,构建含有TAT2BDNF的重组表达载体,为进一步表达融合蛋白及探讨TAT携带BDNF穿透血脑屏障治疗中枢神经系统疾病奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料 ①菌株和质粒:含蛋白转导结构域的pTAT/HA表达质粒,由美国华盛顿大学Dowdy教授惠赠,见图1;感受态细胞DH5a为本实验室保存。②主要材料和试剂:5月龄引产胎儿的胚胎脑组织,液氮中保存;总RNA提取试剂盒、DNA胶回收试剂盒及小量质粒提取试剂盒购于QIAGEN公司,OligodT、XhoⅠ、EcoRⅠ购于Promega公司,凝胶图像分析仪购于美国syugene公司,MarkerDL2000购于上海生工生物工程公司,BD2NF的引物合成及DNA测序由上海生工公司完成。③PCR引物设计:参照GenBank人BDNF全基因序列,应用Omiga基因分析软件分别设计内侧和外侧引物。
1.2 方法
1.2.1 胚胎脑组织的提取 秤取5月龄引产胎儿的脑组织100mg,按照总RNA提取试剂盒说明书提取脑组织总RNA,测定A(260nm)/A(280nm)比值及RNA浓度。
1.2.2 BDNF目的基因的扩增 ①cDNA的制备:以OligodT为逆转录引物,以提取的总RNA为模板,在AMV反转录酶催化下获得含有目的基因的cDNA,反应条件为42℃水浴45min,72℃水浴5min。②巢式PCR扩增:第1轮PCR以cDNA为模板,采用外侧引物扩增含目的基因的大片断,反应μ体积为30L,反应条件为94℃变性5min,52℃退火45s,72℃延伸1min,共35个反应循环,最后72℃延伸5min,反应产物经1.0%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。将鉴定为阳性的第1轮PCR产物稀释50倍后作为模板,采用内侧引物扩增特异目的基因,反应体积为30L,反应条件为94℃预变性5min,55℃退火45s,72℃延伸5min,共25个反应循环,最后72℃延伸5min,第2轮PCR反应产物亦经1.0%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。
1.2.3 pTAT/HA2BDNF质粒的构建 pTAT/HA载体及经纯化回收的PCR扩增产物分别用XhoI/EcoRI核酸内切酶双酶切后,经1.5%琼脂糖凝胶电泳,割胶回收线性载体及BDNF片段,加入T4连接酶反应体系,4℃连接16h,连接产物转化感受态细胞DH5a,37℃恒温培养14h后,挑取阳性克隆,提取质粒,用XhoI/EcoRI酶切,1.5%琼脂糖凝胶电泳鉴定,选取正确的重组质粒载体测序。
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