2 结果
2.1胎脑总RNA的提取及RT2PCR扩增目的基因 28s、18s及5s3条带明显完整且无降解,A260nm/A280nm为1.79,RNA质量
浓度为950mg/L。第1轮PCR产物在电泳图中1000bp处有特异性条带,与预期的957bp接近,为包含目的基因的大片段;第2轮PCR扩增产物行电泳时,在750bp处有特异性条带,与预期的763bp相近,为BDNF目的基因片段,见图3A-B。
2.2 PTAT/HA2BDNF载体的构建及酶切鉴定
重组质粒PTAT/HA2BDNF经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后琼脂糖凝胶电泳显示3.0kb和763bp2个片断,3.0kb的片断为PTAT/HA酶切后的大小,763bp为BDNF基因片断大小,酶切证实构建的表达载体PTAT/HA2BDNF是正确的,
2.3 DNA序列测定 经测序证实,重组表达载体pTAT/HA2BDNF经XhoⅠ和EcoRⅠ双酶切后内插入的碱基组成与GenBank(AF411339)中的人BDNF基因序列完全一致。
3 讨论
自从1989年德国科学家Leibrock等根据所测出的BDNF部分氨基酸残基序列设计PCR引物,用RT2CR方法从猪脑mRNA中成功克隆BDNFcDNA以来,BDNF基因的克隆和表达研究取得重大进展。但是因为血脑屏障只允许分子量小于600Da的蛋白通过,分子量约13KDa的BDNF不能穿透血脑屏障,这给BDNF用于中枢神经系统的治疗带来困难。TAT白转导域的发现及其能穿透血脑屏障的特性,给药物的应用带来希望。为此,本研究构建pTAT/HA2BD2NF载体,以探讨TAT携带BDNF穿透血脑屏障治疗中枢神经系统疾病的可行性。本研究选用的pTAT/HA载体为美国科学家Nagahara构建的能够产生高水平TAT融合蛋白的细菌表达子[12],pTAT/HA末端依次编码6个组氨酸、TAT蛋白的11个氨基酸、血球凝集素标记及多克隆位点。组氨酸标签有利于表达蛋白的纯化及免疫学检测,血球凝集素标记亦有利于免疫学检测,所以pTAT/HA是表达TAT融合蛋白较为理想的载体。本研究采用RT2PCR从胚胎脑组织中克隆BDNF,根据人BDNF的基因序列设计内外侧引物,采用巢式PCR扩增目的基因,从而降低扩增多个靶位点的可能性,提高反应的特异性和灵敏度;将编码BDNF的DNA序列克隆到表达载体PTAT/HA下游,便于直接表达融合蛋白TAT2BDNF。本研究成功构建原核表达载体pTAT/HA2BDNF,重组质粒经菌落PCR和酶切鉴定,测序结果表明克隆片段与报道序列同源性达100%,为下一步表达完整、功能性的融和蛋白TAT2BDNF,研究TAT穿透血脑屏障等打下了基础。
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