2 结果
2.1 目的蛋白的表达 SDS2PAGE电泳可见,pBEX2PPM1A2His经IPTG诱导2、4h后在大肠杆菌中均有表达,4h时获得量最大,空菌诱导4h仅有较弱条带。且PPM1A的产量随IPTG的浓度加大变化不大.
2.2 目的蛋白的纯化和复性 诱导后的菌体处理后经超速离心,SDS2PAGE电泳发现大部分目的蛋白存在于沉淀中,主要以包涵体形式存在。用Ni2NTA纯化试剂盒处理所得的目的蛋白纯度达90%,质量浓度为2.45mg/mL,复性后目的蛋白质量浓度为1.15mg/mL。
2.3 目的蛋白的Western2blot鉴定 空菌组无明显条带,诱导菌组可见较强条带,提示IPTG诱导后所得的蛋白为目的蛋白。
2.4 多克隆抗体滴度检测 纯化的PPM1A重组蛋白0.1g/mL每孔100L包被,ELISA法测得的抗体滴度达到1∶100000。
2.5 多克隆抗体的特异性检测 PPM1A多克隆抗体1∶800作为第一抗体,用Envision免疫组化法检测肝癌组织Edmondson病理分级Ⅰ级中PPM1A的表达,同时用PPM1A鼠单克隆抗体和正常小鼠血清分别为阳性对照和阴性对照为第一抗体检测,结果可见PPM1A多克隆抗体组和PPM1A鼠单克隆抗体阳性对照组的肝细胞胞核和胞浆明显阳性表达,而正常小鼠血清组则无着色;另也用免疫荧光法检测HepG2细胞中PPM1A的表达,PPM1A多克隆抗体1∶50组细胞的胞核阳性着色,正常小鼠血清组则未见明显荧光。
3 讨论
PPM1A蛋白磷酸酶1A(以前2C)(PP2CA;MGC9201;PP2C2ALPHA是一种抑癌基因,定位于染色体14q23.1,47604bp,属于丝/苏蛋白磷酸酶的PP2C家族,为一常见的镁或锰离子依赖的去磷酸化酶,定位于胞浆和核,使MAP激酶和MAPK激酶去磷酸化而起负调节作用;能使细胞周期蛋白依赖的激酶去磷酸化,参与细胞周期的调控;可抑制环境应激反应诱导的p38和JNK激酶级联作用;其过量表达可激活抑癌基因TP53/p53的表达,导致细胞周期停滞于G/M期和引起细胞凋亡,从而可能参与肿瘤的发生机制调节。
TGF2家族成员广泛存在于从果蝇到人类的多种生物的各种组织中,控制多种正常细胞的发育过程,参与一些癌症、自身免疫疾病和纤维化疾病的发生发展。TGF2信号通路的应答中一个关键的步骤就是Smad2被TGF2受体II磷酸化后与Smad3,Smad4形成复合体,移位细胞核中,与序列特异的DNA结合蛋白CRB/P300等结合,启动TGF2通路,激活特定的靶基因。Xu等人研究认为Smad2的磷酸化与去磷酸化对TGF2信号通路的调节起重要作用,而近期发现PPM1A就是那种特异的去磷酸化酶,促进核中Smads的去磷酸而转移出核,PPM1A的异常表达会消除TGF2诱导的抗增生核转录反应,但是删除PPM1A会使哺乳动物细胞中的TGF2号途径活性增高。资料显示TGF2/Smads通路是肝脏细胞生长的一个重要调节因子,参与肝细胞的生长、分化、黏附、转移、细胞外基质的形成及免疫调节等,肝癌组织中磷酸化Smad2核聚集可与肝脏肿瘤的恶性程度密切相关。故而,进一步深入研究肝组织中PPM1A的功能有深远意义。
该试验中,我们利用制备的PPM1A鼠多克隆抗体,采用免疫组化法检测肝癌组织中PPM1A的表达,显示其结果与用PPM1A单克隆抗体检测相似,用免疫荧光法检测了HepG2细胞中的PPM1A的表达主要定位于胞核,与文献报道的结果一致示了PPM1A鼠多克隆抗体能特异地检测肝组织中PPM1A的表达,为下一步深入研究肝细胞中PPM1A的功能以及与TGF信号通路的联系对肝癌发生的影响等研究打下了基础,为寻找新的治疗策略提供了参考资料。
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