微生物鉴别方法：分子生物学方法

1、DNA碱基比
   DNA碱基比[（G+C）mol%]，以G+C物质的量分数（mol%）表示：
  （G+C）mol%=（G+C）/（A+T+G+C）%
  该比值的变化范围很大，原核生物变化范围是20-78%，真核生物的变化范围为30%-60%。
   目前已经测定了大量生物的DNA碱基组成这方便的结论有：①亲缘关系密切而表型又高度相似的微生物应该具有相似的DNA碱基比；不同微生物之间的DNA碱基比差别很大，则表明它们之间亲缘关系疏远。②DNA碱基比相同或相似的微生物并不一定表明它们之间的亲缘关系就一定相近，这是因为DNA碱基比只是指DNA中4种碱基的含量，并未反映出碱基在DNA分子中的排列顺序。③一般认为，DNA碱基比相差超过5%就不可能是属于同一个种，DNA碱基比相差超过10%可考虑是不同属。
   DNA碱基比可用化学方法或物理方法测定。目前比较常用物理方法进行测定，尤其是热变性温度法。该法是用紫外分光光度计测定DNA的熔解温度（Tm）。它的基本原理是：首先将DNA溶于一定离子强度的溶液中，然后加热。当温度升到一定的数值时，两条核苷酸单链之间的氢键开始逐渐被打开（DNA开始变性）分离，从而使DNA溶液365紫外吸收明显增加；当温度高达一定值时，DNA完全分离成单链，此后继续升温，DNA溶液的紫外吸收也不再增加。DNA的热变性过程（即增色效应的出现）是在一个狭窄的温度范围内发生的，紫外吸收增加的中点值所对应的温度称为该DNA的热变性温度或熔解温度。在DNA分子中，GC碱基对之间有3个氢键，而AT碱基对只有2个氢键。因此，若细菌的DNA分子G+C含量高，其双链的结合就比较牢固，使其分离成单链则需较高的温度。在一定离子浓度和一定pH的盐溶液中，DNA的Tm值与DNA的G+C含量成正比。因此，只要用紫外分光光度计测出一种DNA分子的Tm值，就可以计算出该DNA的G+C含量。
2、核酸的分子杂交
   DNA碱基比相同或相近的微生物，其亲缘关系并不一定相近。这是因为DNA碱基比的相同或相近并不反映碱基对的排列顺序相同或相近，而微生物间的亲缘关系主要取决于它们碱基对的排列顺序的相同程度。因此，要确定它们之间的亲缘关系就要进行核酸的分子杂交试验，以比较它们之间碱基对序列的相同程度。核酸的分子杂交试验在微生物分类鉴定中的应用主要包括DNA-DNA分子杂交和DNA-rRNA分子杂交等方法。
①DNA-DNA分子杂交：该方法的基本原理是利用DNA双链解离成单链（变性），单链结合成双链（复性），碱基配对的专一性，将不同来源的DNA在体外解链，并在合适的条件下使单链中的互补碱基配对结合成双链DNA。然后根据能生成双链的情况，测定杂合百分比。
    核酸的分子杂交的具体测定方法按杂交反应的环境可分为液相杂交和固相杂交两大类，前者在溶液中进行，后者在固体支持物上进行。在这些方法中，有的需要用同位素标记的DNA，有的则用非同位素标记。在细菌分类中，常用固相杂交法进行测定。这种方法的大致做法是：将未标记的各微生物菌株的单链DNA预先固定在硝酸纤维素微孔滤膜（或琼脂等）上，再用经同位素标记的参考菌株的单链DNA小分子片段在最适复性温度条件下与膜上的DNA单链杂交；杂交完毕后，洗去滤膜上未配对结合的带标记的DNA片段；然后测定各菌株DNA滤膜的放射性强度。以参考菌株自身复性结合的放射性计数值为百分之百，即可计算出其他菌株与参考菌株杂交的相对百分数。这些百分数值即分别代表这些菌株与参考菌株的同源性或相似性水平，并以此数值来判断各菌种间的亲缘关系。
②DNA-rRNA分子杂交：DNA中（G+C）mol%测定和DNA-DNA分子杂交方法为微生物种和属的分类鉴定研究开辟了新的途径，解决了以表型特征为依据所无法解决的一些疑难问题。许多研究表明，当两个菌株的DNA配对碱基少于20%时，DNA-DNA分子杂交往往不能形成双链，因而限制了DNA-DNA分子杂交方法在微生物种以上单元分类中的应用。当两个菌株的DNA-DNA杂交率很低或不能杂交时，用DNA-rRNA杂交仍可能出现较高的杂交率，因而可以用来进一步比较关系更远的菌株之间的关系，进行属和属以上等级分类单元的分类。DNA-rRNA杂交和DNA-DNA杂交的原理和方法基本相同，都是利用核酸复性的规律。但两种方法也有差异：
A. 在DNA-rRNA分子杂交中，同位素标记部位在rRNA。
B. DNA-rRNA分子杂交结果是以Tm值来表示。Tm值越高，表示亲缘关系越近。
③核苷酸序列分析从本章第一节可以看出，16SRNA大分子在生物进化研究中起着重要的作用。新的细菌分类系统与传统的细菌分类体系相比，也存在较多的差异，这主要表现在：
A、改变了细胞壁结构作为亲缘关系划分的标志之一，如无细胞壁的支原体，实际是革兰氏阳性的芽孢梭菌的一个后代分支。
B、改变了营养类型作为种系发生的特征，如光合细菌并非是独立于非光合种群的进化分支，而是每种光合种群都代表了一个高阶的分类单元，其后代分支包括非光合细菌。
C、尽管革兰氏阳性细菌是系统发育关系密切的一群细菌，但革兰氏阴性菌却包括了10个亚群。
 
   

 

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