提高繁殖速度的方法

                           提高繁殖速度的方法 
 
1、试管繁殖速率及计算
    统计试管苗增殖速度，有以苗为单位，也有以芽或未生根的小茎作单位的，以原球茎球状体或胚状体因难以统计，则以瓶为单位。大多数以芽和苗作单位。
    由于试管苗在无菌条件下生长，营养充足，温度适宜，光照充分，100%的相对湿度，又不受季节、气候的限制，也无病虫的危害，故增殖极快，那么，怎样计算其增殖速度呢？计算增殖速率有理论计算和实际计算两种。实践中要受到多种因素制约，困难很多，因此实际产苗要远远低于理论数字。但理论计算可以作为一个计算产量的指标，提供参考，有它的积极意义。试管苗理论上一年能繁殖多少，可用下面的简单公式计算：
    Y=mXn
    Y= 年繁殖数
    m=无菌母株苗数
    X=每个培养周期增殖的倍数
    n=全年可增殖的周期次数
    例如月季每5周转接一次，甲品种每次增殖3倍，乙品种每次增殖5倍，丙品种每次增殖7倍，假定一开始都是一个芽，那么这三个品种一年能繁殖多少呢？根据公式可知：
    n= =10.4，即每年可转接10次，那么这三个品种年繁殖率分别计算如下：
    甲品种Y=1×310=59000=5.9×104
    乙品种Y=1×510=9760000=9.76×106
    丙品种Y=1×710=282000000=2.82×108
2、 提高繁殖速度的方法
    不仅试管苗的繁殖类型不同，而且在试管内又受到基因型、外植体来源、年龄、部位、培养基种类、附加成分和培养环境等多种因素的影响，应通过具体试验来摸索每种植物最快最好的繁殖方法。
    1.改进培养基 
    长期以来，根据培养的组织不同，目的不同，已设计了许多种培养基。初代培养能否进行增殖，培养基的选择是一个关键。MS培养基可以适用于许多植物的培养，但在大量组织器官培养中发现，由于其无机盐浓度较高，对某些植物来说出现了抑制生长甚至毒害作用，例如，扑虫堇（pinguicula moranensis）的叶，接种到1/2LS培养基中死亡率很高（LS和MS的无机盐一样），在1/5LS培养基中效果很好，而越橘的嫩茎在1/4MS培养基中生长良好，作为热带气生兰的许多种类均需要较低的盐浓度。
    糖类具有维持培养基渗透压的作用，在培养过程中，组织不断地从培养基中吸取糖，随时间增长，逐渐降低了糖的浓度，不能维持正常的渗透压，这种情况下应尽快将材料转移至新鲜的培养基，否则影响试管苗的生长。
    在植物组织培养中所用的维生素类绝大部分为B族维生素，如硫胺素、烟酸、叶酸、生物素等，它们以各种辅酶的形成参与代谢活动，影响形态发生、分化及试管苗的生长。有的外植体或愈伤组织能自己合成各类维生素，但在没有研究和确定的情况下，一般均加入，以防缺乏。
    植物生长调节物质，在试管苗增殖中起决定性的作用，由于植物体内源激素难以测定，因此，外源激素的加入靠一系列的试验来修正。下面叙述试管内增殖的三种不同途径和使用不同的植物生长调节物质。
    （1）促进腋芽形成和生长的激素 高等植物的每一个叶腋中都有腋芽，在一定条件下可使它生长。现在知道顶端优势抑制芽的生长可被外源的细胞分裂素打破，所以在利用这条途径来增殖时，几乎都要加入细胞分裂素。由于细胞分裂素的持续作用，腋芽不断分化和生长，逐渐形成芽丛。反复切割和转移到新的培养基中继代培养，就可在短期内得到大量的芽。除了细胞分裂素以外，培养基中还经常加入低浓度的生长素，以促进腋芽的生长，但要防止愈伤组织化。有时还加入低浓度的赤霉素 ，以促进腋芽的伸长。在实际操作中，一般高浓度细胞分裂素和低浓度生长素的配比，既能提高腋芽的增殖速度，也能保证腋芽健壮生长，为后续的生根移栽打下良好基础。如果细胞分裂素浓度过高生长素浓度过低，会形成过于细密的嫩芽，虽然提高了增殖速度，但苗多而弱，降低了芽的质量，不适宜作为生根或移栽用苗，这不免是一种浪费。但这并不意味着促进腋芽的增殖必须同时需要生长素和细胞分裂素。许多情况下只用细胞分裂素也可以达到优质的增殖芽。
    （2）诱导不定芽形成和生长的激素 除现有的芽之外，任何器官上的，通过器官发生重新形成的芽称为不定芽。促进外植体形成不定芽，要使用一定量的细胞分裂素和生长素，一般浓度不能过高。否则不但使器官分化能力降低，而且也使遗传性难以稳定。诱导外植体形成不定芽时，一般使用细胞分裂素的浓度高于生长素浓度的配比，但也经常采用细胞分裂素和生长素浓度的比值接近于1的配比。有的材料还需加入低浓度的2,4-D才能诱导不定芽的产生。具体应用时应查阅资料，并通过大量筛选来寻找最适当的细胞分裂素和生长素种类和浓度的配比。但总的原则还是如上所述，不能片面追求增殖率，既要求一定的增殖率，也要保证小苗的质量。
    （3）促进胚状体的形成和繁殖的激素 胚状体途径的优点是增殖率高，而且同时具有胚根和胚芽，可免去生根。现在胚状体发生还不普遍或产生的胚状体难以成株或成株率太低，以及遗传性尚不稳定，故仅在有限植物中应用。一般是在含有丰富还原氮的培养基上，加有生长素，特别是2,4-D以诱导胚状的发生，然后转移到降低浓度或没有生长素的培养基上使其成熟、萌发和生长。培养基中，还可加入其他附加成分，如氨基酸，水解乳蛋白（LH）300mg/L～500mg/L，水解酪蛋白（CH）200mg/L～500mg/L，以及腺嘌呤（ADE）1mg/L～80mg/L等，以促进试管苗的生长。
    2、改善培养条件
    试管苗增殖与培养条件如温度、光照、湿度、培养器皿和培养基的pH值密切相关，需要进行控制，以促进繁殖。
    （1）温度(temperature) 
    不同植物增殖的最适温度不同，大多采用25±2℃的温度。一般低于15℃时，培养的组织生长出现停滞，而高于35℃对生长也不利。促进芽的形成温度略低，如烟草芽形成以18℃最好，12℃以下，33℃以上成芽率均低。增殖苗的温度一般是恒温，也有昼夜变温下生长效果比恒温好的，如百合。在考虑某种培养物的温度要求时，也应考虑原植物的生态环境所处温度条件，如松树一般生长在较高的海拔及较低的温度环境，在较高温度的培养条件下其试管苗生长变慢，有人采用两到三个月的模拟冬天的低温环境，又使生长恢复。温度预处理也对试管苗增殖有影响。高温处理不仅可获得无病毒植株，也影响到器官发生。草莓的茎尖分生组织经38℃处理3d～5d，提高了无病毒茎尖分生组织的成活率。天竺葵一个品种分别用10℃、20℃和30℃等不同温度处理1周～4周，培养8周后，以10℃处理的茎尖繁殖数最高，20℃处理的其次，30℃处理的最差，在木本植物的胚培养中，发现胚在2-5℃条件下进行一定时间的低温处理，有利于提高胚的成活率，如桃。
    （2）光照(light) 光对试管苗生长增殖也有明显影响，表现在光照、光质和光周期等方面。光照强度对细胞、组织的增殖和器官的分化研究尚少，因此看法不一致。在一些植物（如荷兰芹等）的组织培养中，发现器官形成不需要光；而另一些植物（如菊芋、卡里佐枳橙）的组织培养中，则发现光对器官的形成有重要作用。据报道用黑暗、2200lux和5700lux等不同光照处理卡里佐枳橙的茎尖培养，茎尖分化新梢数随着光强增加而增加，分别增加153.8%和238.5%。吴绛云发现对光照显著促进黑穗醋栗幼苗的增殖。而王际轩等培养苹果砧木的芽，通过暗培养产生黄化苗，明显提高茎尖增殖率。关于光周期，试管苗的增殖与分化，许多研究者都选用一定光周期来培养，最常用的光周期是16h光照，8h黑暗。有人发现菊芋块茎器官的分化，每天1h600lux光照有促进，到12h由达最高限度，再增加则无作用。曹孜义等用连续光照培养葡萄试管苗，绝大多数品种可加快苗的增殖，而且使苗生长健壮。王永明发现一月以上每日10h以下光照，会使部分苗生长停止和封顶，若延长至12h～16h，则可消除。如果诱导试管内花的形成，那日照长短则是一个重要因素。
    （3）湿度 (humidity)培养容器内的相对湿度几乎可达100%，而环境中的湿度会影响培养基湿度，培养室温度太低，培养基易失水、干裂，影响生长，过高则易引起棉塞长霉，造成污染。一般要求在70%～80%的相对湿度，过低应洒水，过高应通风除湿。
    （4）pH值 (pH value)试管苗的增殖都要一定的PH值。如果PH值不适，则直接影响试管苗对营养物质的吸收，从而影响到生长和繁殖。除特殊要求外，一般培养基PH值都在5.6～6.0之间。
    (5)渗透压(penetrating pressure)
    培养基中由于有添加的盐类、蔗糖等化合物，因此，而影响到渗透压的变化。通常1—2个大气压对植物生长有促进作用，2个大气压以上就对植物生长有阻碍作用，而5—6个大气压植物生长就会完全停止，6个大气压植物细胞就不能生存。
    （6）气体(air)
    试管苗生长和繁殖需要氧气。进行固体培养时，如果瓶塞密闭或将芽埋入培养基会影响生长和繁殖。液体培养，则需进行振荡和旋转或浅层培养以解决氧气供应。试管苗增殖培养时，应注意避免有害气体的进入，如SO2、乙烯等的伤害。  
   

 

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