组培过程中的褐化问题

组培过程中的褐化问题
 
  许多植物的组织培养中发现有褐变现象，尤以木本植物组织培养中褐变严重。褐变主要发生在外植体、愈伤组织的继代、悬浮细胞培养、原生质体的分离与培养等。褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。

    [1] 褐变的机理

    正常细胞内，区域性分布使底物与PPO不能接触并不发生褐变，当细胞膜的结构发生变化和破坏时，酶和底物就结合在一块，在氧的作用下，生成醌，从而引起褐变。

    引起褐变的条件：氧、引起褐变的酶、底物，缺一不可。

    引起褐变的酶：多酚氧化酶（PPO是主要的）、过氧化物酶（POD）、、苯丙氨酸解氨酶等 。引起褐变的酶的底物：主要是酚类化合物，可分成3类：

    第一类是苯基羧酸，包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等；

    第二类是苯丙烷衍生物，包括肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等；

    第三类是黄烷衍生物，包括花青素、黄酮、芸香苷等。

    [2] 影响褐变的因素

    因子是复杂的，随植物的种类、基因型、外植体部位及生理状态等的不同，褐变的程度也有所不同。

    A.植物种类及基因型

    红豆杉愈伤组织的诱导及继代培养过程中，常常发生培养细胞褐变现象，轻者影响细胞生长和繁殖，重者导致细胞死亡。

    豆科植物和芸苔属植物原生质体培养中容易褐化也是一个普遍的问题，

    橡胶的花药培养中，海垦2号花药的褐变较少，因而愈伤组织的诱导容易；而有些品系花药容易褐变，因而愈伤组织的诱导困难。在组织培养中，有些品种、品系难以成功，而有些则容易成功。

    油菜叶原生质体品种373褐化比品种94591、95386严重

    B.外植体部位及生理状态

    荔枝茎的愈伤组织中度褐变，而根的愈伤组织全部褐变。

    欧洲栗幼年型的材料培养时含醌类物质少，成年型材料培养时含醌类物质多，后者比前者褐变严重。

    油棕幼嫩外植体（如胚）培养较少褐变，高度分化的叶片接种后则容易褐变。

    C.培养基成分及培养条件

    硬紫草从长期继代培养且次生代谢物含量高引起培养物的褐变。

    用B5培养基可有效地防止褐变。

    茼蒿用甘露醇或蔗糖作为渗透压调节剂易发生褐变，不能或只能形成少量细胞团用葡萄糖作渗透压调节剂褐变较少，效果好。

    柿树ZT 9.13μmol/L、IAA 0.57μmol/L减轻褐变程度。BA或 KT 提高了褐变

    甘蔗组织培养中易产生褐变。

    荔枝培养基添加1 mg/L6-BA +0.5 mg/L 2,4-D时，愈伤组织较硬、增殖缓慢、易褐变；培养基添加1 mg/ L 6-BA+1 mg/L2,4-D时，愈伤组织浅黄疏松、增殖快[4]。D.pH值影响材料的褐变

    大白菜pH值至6.5，很大程度上可抑制褐变。

    水稻pH值为4.5 ～5.0时， 生长状态良好的，其表面呈黄白色，pH值为5.5 ～ 6.0时，愈伤组织严重褐变。

    E.培养条件不适宜

    温度过高或光照过强，均可使PPO的活性提高，从而加速被培养的组织褐变。

    高浓度CO2也会促进褐变，其原因是环境中的CO2向细胞内扩散，使细胞内CO32+增多，产生褐变。

    [3] 克服褐变的方法a.选择适当的外植体

    成年植株比实生幼苗褐变的程度严重，夏季材料比冬季及早春和秋季的材料褐变的程度强。而冬季的芽进入深休眠状态，不太容易生长，所以最好选用早春和秋天的材料作为外植体。取材时还应注意外植体的基因型及部位，选择褐变程度较小的品种和部位作外植体。

    b.对外植体进行预处理

    空白琼脂培养基中培养5-7天，使组织中的酚类物质部分渗入培养基中。 再转移培养基2-3次，切口愈合后，褐变减轻。

    c.选择适宜的培养基与培养条件设置不同试验，进行选择。

    d.添加褐变抑制剂与吸附剂

    有机酸\抗坏血酸、半胱氨酸\柠檬酸、苹果酸和α-酮戊二酸\水解乳蛋白、植酸（PA）\SO2和亚硫酸盐\、脂肪氧化酶、抗坏血酸氧化酶\硫脲、二氨基二硫代甲酸钠、2-巯基苯并噻唑、氯化钠等也是PPO的抑制剂。 聚乙烯吡咯烷酮（PVP）是酚类物质的专一性吸附剂，活性炭是一种吸附性较强的无机吸附剂，，能吸附各种微量物质和微小颗粒，

    e.进行细胞筛选和多次转移

    进行细胞筛选，剔除易褐变的细胞。外植体接种后1~2天立即转移到新鲜培养基中或同一瓶培养基的不同部位，这样能减轻醌类物质对培养物的毒害作用，连续转移5~6次可基本解决外植体的褐变问题。

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