化学因子
(一)化学灭活剂病毒的化学灭活剂包括酶类、蛋白变性剂、氧化剂、酸、碱以及破坏胺基的其它化学剂，如福尔马林和亚硝酸等。1.酶类酶类的灭活作用随病毒种类而不同。大多数病毒的衣壳蛋白或囊膜，或者两者都能保护核酸，使其不受核酸酶的分解作用。但在某些病毒，衣壳蛋白亚单位之间的结合比较疏松，其裂隙足以使酶通过，例如黄瓜花叶病病毒在用低浓度的RNA酶处理后即丧失感染性。动物病毒中有无这类例子，尚待探索。但是必须指出，衣壳蛋白在其它理化学因子的作用以后发生损伤时，病毒核酸就易遭受核酸酶的分解作用。磷脂酶因破坏囊膜磷脂而使囊膜病毒灭活，可能是破坏了病毒粒子上有关吸附和侵入的结构。蛋白酶，包括胰酶、胰凝乳蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶和灰色链丝菌酶等，因能除去有囊膜病毒表面的受体，使病毒粒子丧失吸附细胞的能力；或因破坏病毒粒子的衣壳蛋白，暴露病毒核酸，遭受核酸酶的作用而灭活。某些病毒，如小RNA病毒科的肠道病毒，对消化道内的蛋白酶具有很大的抵抗力，因此可以无损伤地通过消化道和引起感染。但痘病毒以及与肠道病毒同属于小RNA病毒科的鼻病毒，却对蛋白酶敏感。病毒对酶类的抵抗力，在相当程度上决定着病毒的病原性和感染方式。如上述，引起消化道感染的肠道病毒都对动物消化道内的蛋白酶具有强大抵抗力。相反，痘病毒不能抵抗胃肠中蛋白酶的作用，通常不发生消化道感染(除非在咽喉部侵入)，而主要经呼吸道或因直接接触而感染。披膜病毒例如乙型脑炎病毒，在这方面表现得尤为明显：小鼠即使经口摄入大量病毒材料，如啃食脑炎死亡鼠的脑，也不发生感染，但将这种鼠脑作几万至几十万倍稀释后给小鼠作皮下或腹腔，特别是脑内注射时，却常可以规律地引起感染。2.pH一般来说，大多数病毒的活性在pH6～8的范围内稳定，在pH50以下的酸性环境中以及pH90以上的碱性环境中，则迅速灭活，但是不同病毒对pH变化的稳定性差异很大。例如呼肠孤病毒能够抵抗pH30，肠道病毒在pH22可于24小时内继续保持其感染性，而鼻病毒等却可被pH53迅速灭活，口蹄疫病毒对pH变化更为敏感，在pH60～65以及pH80～90均迅速灭活。披膜病毒可在较高的pH环境(80以上)中保持稳定。因此，对pH的稳定性是病毒鉴定上的一个重要指标。有趣的是，某些脊髓灰质炎病毒毒株在pH40～50的醋酸、草酸和乳酸溶液中对50℃的抵抗力明显高于其在pH72的蒸馏水中的抵抗力。同样，盐酸、硝酸、磷酸和硫酸等无机酸类也可在pH30～50条件下提高脊髓灰质病毒某些弱毒株对50℃的稳定性。但是，酸性环境对大多数强毒株脊髓灰质炎病毒没有提高稳定性的作用。根据某些病毒的耐酸特性，病毒学实验中已经成功地应用酸性解离方法由病毒抗体复合物中分离感染性病毒。例如Mandei等将脊髓灰质炎病毒抗体复合物的pH降至20～25，Pinheiro等将柯萨奇病毒抗体复合物的pH降低至25，分别分离获得了感染性病毒。酸、碱溶液是病毒学实践中经常应用的消毒剂，例如污染脑炎病毒的塑料制品(聚苯乙烯滴定板等)，就可用1%～3%盐酸浸泡消毒。应用2%～3%NaOH溶液或生石灰碱溶液消毒口蹄疫病毒的污染环境和用具等等。保存病毒，以中性或稍偏碱为宜。〖BT4〗3.脂溶剂包括乙醚、氯仿和丙酮、氟碳化合物、正丁醇等可以脱脂的化学物质。乙醚、氯仿和丙酮能够灭活有囊膜病毒。但是这三种脂溶剂对囊膜脂质的溶解能力不尽相同。一般来说，乙醚具有最大的破坏作用，氯仿次之，丙酮的溶解能力最弱。应用丙酮处理披膜病毒感染的标本，虽有暴露病毒蛋白抗原的作用，但病毒往往并不完全灭活。各种痘病毒对乙醚的敏感性不同。禽痘病毒对乙醚有抵抗力，哺乳动物痘病毒则可分为对乙醚敏感和对乙醚不敏感两类。牛痘病毒、痘苗病毒、兔痘病毒和小鼠脱脚病病毒等正痘病毒对乙醚有抵抗力，而绵羊痘病毒、山羊痘病毒及及兔粘液瘤病毒和绵羊接触传染性脓疱性口炎病毒等对乙醚敏感。后来发现，对乙醚敏感的痘病毒大多引起类似的细胞病理变化，抗原性上也较接近或类同。乙醚灭活试验还是病毒鉴定中的一个重要指标。氟碳化合物(氟里昂)和正丁烷也有抽提脂质和蛋白质的作用，故常用于病毒提纯，特别是由病毒抗体复合物中解离病毒粒子或由感染材料中提取病毒抗原。正丁烷还能区分和选择性地破坏病毒核蛋白，故在混合性病毒感染材料中可以用其消除一种病毒的感染性，而保持另一种病毒的感染性(或抗原性)。〖BT4〗4.甲醛和戊二醛甲醛及其37～40％溶液即福尔马林，是病毒学中普遍应用的一种病毒灭活剂，在灭活疫苗的制造中尤为常用。甲醛对病毒核酸和病毒蛋白质都有破坏作用，但首先是使病毒核酸灭活——与腺嘌呤、鸟嘌呤和胞嘧啶等含有胺基的碱基结合而使病毒核酸变性。甲醛较高浓度和较长时间的作用，可与病毒蛋白质的胺基结合而形成羟甲基衍生物或二羟甲基衍生物，后者再与酰胺发生交联反应，如图5-3所示。病毒蛋白质因而变性，阻止病毒核酸的逸出。甲醛对单链核酸最为有效，故常用于RNA病毒的灭活。双链核酸病毒对甲醛的抵抗力较大，因此常需应用较高浓度的甲醛或者进行较长时间的作用，这样可使病毒蛋白质受到较大损伤，从而在一定程度上降低其免疫原性。为保证甲醛有效地进入病毒粒子内部作用于核酸，有人建议将病毒材料稍稍加温，使病毒衣壳壳粒之间形成较大的间隙，以便甲醛分子透入。在用甲醛灭活痘病毒和伪狂犬病病毒(疱疹病毒)时，就曾应用过这种方法。对于易因加温变性的病毒，例如披膜病毒和正粘病毒，当然不宜采用这样的灭活方法。适当浓度的甲醛灭活病毒后，病毒抗原性、血凝性均不改变，故常用其灭活病毒制造疫苗，迄今应用的灭活病毒疫苗，约有50%以上是用甲醛作灭活剂，通常应用005%～01%～02%浓度的福尔马林。其它病毒制品如血凝抗原、补体结合抗原、琼扩抗原也常以甲醛灭活病毒制备。戊二醛对病毒的作用与甲醛相似，但灭活作用更强，2%碱性戊二醛溶液在1分钟内能杀灭所有病毒。在病毒学中，戊二醛常用于实验室污染器材如超净工作台、离心机的擦拭消毒。用强化酸性戊二醛(含025乙烯脂肪醇醚)代替常用的3%～5%石炭酸溶液浸泡污染的吸管、试管等，具有可靠的消毒效果。〖BT4〗5.烷化剂烷化剂如氮芥、磺酸酯、氮丙啶、乙撑亚胺、环氧乙烷、环氧丙烷、溴化甲烷、β丙内酯、乙基乙烯亚胺(EEI)、乙酰乙烯亚胺(AEI)等，带有一个或多个活性烷基，能使蛋白质分子上游离的羧基(COOH)、氨基(NH2)、巯基(SH)、羟基(OH)和核酸分子中的N发生烷基化作用，使病毒的蛋白质和核酸结构改变，功能丧失，从而被灭活。在病毒学中，作用剧烈的烷化剂如环氧乙烷等常用作气体消毒剂。对多种病毒均有灭活作用，甚至对血清或鸡胚尿囊液等有机物中存在的病毒亦能有效杀灭。实验发现，1%环氧乙烷水溶液处理12～24小时，可完全杀灭血清稀释的鸡新城疫病毒、流感病毒、鼠脑脊髓炎病毒、牛痘病毒等。Sidwell用100%环氧乙烷气体消毒，29℃6小时或60℃48分钟，可使污染在羊毛华达呢布片上的疱疹病毒、牛痘病毒、副流感病毒、脊髓灰质炎病毒减少到可检出水平以下。常用10%氧化乙烯消毒不耐热的橡胶和塑料制品。在作实验室消毒时，可用3%～5%浓度，处理12～24小时。β丙内酯杀灭病毒的作用也很强，1g/Lβ丙内酯，在37℃作用2小时后即可杀灭血浆中的西方马脑炎病毒、东方马脑炎病毒、淋巴脉络丛脑炎病毒、圣路易脑炎病毒、狂犬病病毒等。到目前为止，以流感病毒、猪瘟病毒、腺病毒、乙肝病毒、痘病毒、黄热病毒、微小RNA病毒、疱疹病毒、东方马脑炎病毒、西方马脑炎病毒、委内瑞拉脑炎病毒、狂犬病病毒、鼠脑炎病毒等作试验，β丙内酯气体均能有效地将其杀灭，一般认为，β丙内脂气体杀灭病毒的有效浓度为5～30mg/L。低浓度的β丙内酯(2～4mg/L)以及作用缓和的烷化剂如乙基乙酰亚胺(EEI)、N乙酰乙烯亚胺(AEI)、缩水甘油醛等可以破坏病毒核酸，但不改变病毒蛋白质，因此也是灭活疫苗制造中很常用的病毒灭活剂。主要使病毒核酸的嘌呤和嘧啶基发生改变。但是各种病毒对这些化学剂的抵抗力不尽相同。同时因为这些化学剂对核酸具有较强的诱变作用，可能诱导产生突变型病毒株。因此必须保证每个病毒核酸分子都被灭活。实践中应根据病毒材料的种类和状态，应用正确浓度、使用方法、作用时间、温度等等。〖BT4〗6.蛋白变性剂包括石炭酸以及阴离子去垢剂，如十二烷基硫酸钠(SDS)和去氧胆酸钠等以及非离子去垢剂，如吐温20、吐温80和NP40等。石炭酸和SDS主要用于病毒核酸提取，亦即用以剥离病毒粒子的蛋白衣壳，以便提取病毒核酸。SDS能使病毒蛋白质降解为多肽，故在分析病毒多肽种类时，经常先用SDS处理病毒粒子，随后再用聚丙酰胺凝胶电泳技术加以分离和鉴定。SDS还有溶解病毒囊膜的作用。吐温和去氧胆酸钠等去垢剂具有破坏病毒囊膜的作用，但可保存病毒粒子原来的蛋白结构和抗原性，故常应用于病毒疫苗和病毒抗原的生产工艺中。去垢剂和脂溶剂结合使用，可有效地灭活有囊膜病毒。周铁群等证实，以水泡性口炎病毒为指示病毒，加至血液制品中，在终浓度为03%的TNBP和10%的吐温、25±1℃的条件下作用60分钟，可将指示病毒杀灭至检测限以下。近年来将这一原理应用于去除血液和其它生物制品中可能污染的有囊膜病毒，已成为通用方法，即所谓的S/D法(脂溶剂/去垢剂法)。高浓度的尿素和胍因能作用于氢键和氨基酸残基上非极性侧链之间的疏水键，而使病毒蛋白变性。Cooper等应用32P标记的脊髓灰质炎病毒进行尿素灭活试验，发现72mol/L的尿素最初破坏病毒对热的抵抗力及其吸附宿主细胞的能力，但不改变病毒粒子的物理结构及其与抗体的结合能力。感作时间延长，则病毒粒子破裂，释出病毒RNA，并残留蛋白外壳。Dorman应用同样浓度的尿素处理A２型流感病毒，发现尿素具有自病毒粒子中分离可溶性补体结合抗原的作用。高浓度胍的长时间处理，可使病毒蛋白最后降解为多肽。〖BT4〗7.醇类醇类中的乙醇和异丙醇是实验室、化验室以及床处置中常用的皮肤消毒剂，尽管它们对细菌和其它微生物有较强的杀灭作用，但对病毒的杀灭作用不强(表5-2)，曾有人从75%乙醇溶液中检出了乙型肝炎病毒的表面抗原，所以，醇类物质不是病毒学中可靠的消毒剂。用乙醇浸泡或用酒精棉球擦拭污染的采血针、刀片等病毒污染的实验器材都不是完全有效的消毒措施。不同病毒对乙醇和异丙醇的敏感性差别比较大，相比之下，乙醇对无囊膜病毒的杀灭作用比异丙醇强，反过来，异丙醇对有囊膜病毒作用强些。
8.染料及其光动力作用某些具有扁平芳香族发色团的染料，插入核酸的相邻碱基之间，常可导致移码突变，或抑制RNA的转录，造成病毒突变或失活。染料对病毒的破坏作用，其主要对象是核酸，病毒蛋白包括囊膜中的蛋白并不发生严重破坏，一般仍能保持病毒粒子的免疫原性。吖啶橙插入核酸链后，荧光显微镜下单、双链核酸呈现不同颜色的荧光，是病毒核酸理化特性鉴定的一个重要指标。人们很早以前还发现，某些病毒在用美蓝处理后，一经暴露可见光线，就迅速灭活。后来发现其它染料，例如台盼蓝、中性红和甲苯胺蓝等也有这种作用，统称染料的光动力作用。一般认为，这些染料易于通过病毒的囊膜和衣壳，直接进入病毒粒子的内部而与核酸结合，扰乱或置换核酸分子中的嘧啶基，破坏病毒核酸的结构，使病毒粒子丧失感染性。也有人认为光动力作用是病毒核酸的鸟嘌呤残基发生变化的结果。由于染料必须在有氧条件下才能呈现光动力作用，而还原剂又能减轻光动力作用对病毒的损伤，因此，光动力作用可能就是染料参与的一种光氧化过程。感性不同，以痘病毒、腺病毒、披膜病毒、疱疹病毒、弹状病毒、反转录病毒和乳多空病毒为最敏感。染料对某些病毒的光动力作用具有实践意义。一方面，可以应用光动力作用灭活血液等生物制品中可能污染的病毒，例如Lambrecht等报道，在冻干血浆中加入高滴度人I型免疫缺陷病毒(HIV1)，再加入1μmol/L的美蓝，光照5分钟，病毒的感染滴度下降43个数量级，光照
10分钟则下降632个数量级(检测极限以下)。另一方面，在蚀斑试验中，由于营养液或覆盖琼脂层中含有中性红或其它染料，为避免这些染料的光动力作用对病毒的损伤，必须将细胞培养物放于暗盒内，尽量避光，以保证病毒蚀斑的产生。
(二)保护剂有一些化学物质如甘油、蔗糖、谷氨酸钠等等，能够减轻病毒保存过程中其它理化学因子对病毒的损伤，从而保持病毒的感染性、抗原性等生物活性，这类物质即保护剂。1.甘油甘油是众所周知且被广泛应用的病毒保护剂。因在50%甘油盐水中，大多数细菌被杀灭但病毒却可活存达几十天、几个月甚至几年(决定于病毒的种类)。病毒学实践中常用50%甘油盐水保存含病毒材料，同时采取冷藏措施，效果比较理想。但是必须指出，少数病毒，例如牛瘟病毒，并不能在甘油盐水中长期活存。2.二甲基亚砜(DMSO)可减少冷冻过程中微小冰晶的形成，因而对冻存的病毒有保护作用3.病毒冻干用保护剂常用的有明胶、血清、胨、白蛋白、谷氨酸钠、脱脂奶、乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、聚
乙烯吡咯酮等，这些物质对病毒中的最终水分含量不致过低，可防止蛋白质的变性，高分子物质如血清、明胶、白蛋白等能促进病水复原时，还能够提高溶解性。
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