马铃薯脱毒快繁及工厂化生产技术

摘要：本文就马铃薯茎尖脱毒技术、试管苗快繁、试管薯及微型薯生产及工厂化生产工艺流程等方面，全面总结近年来的研究结果。详细描述马铃薯脱毒技术操作及试管苗、试管薯、微型薯工厂化生产各阶段的技术要点和应注意的问题。
    关键词：马铃薯，脱毒快繁，工厂化生产
    马铃薯种薯“退化”主要是由病毒引起的，通过茎尖分生组织培养及后期的良繁体系能够获得“无病毒”的“复壮”健康种薯。我国丛0世纪70年代初开始研究推广这一技术，现已作为一种成熟技术被广泛应用，实践证明用高质量的脱毒种薯可使产量增加30%-50%。马铃薯脱毒快繁技术，包括脱毒材料的选择，茎尖分生组织培养，试管苗的快速微繁殖，试管薯的诱导，人工隔离条件下的扦插生产微型薯，以及天然隔离条件下的各级脱毒种薯生产。
    1 脱毒材料的选择
    对准备进行脱毒复壮的马铃薯品种，或材料进行田间株选和薯块选择是非常重要的。它不仅能提高脱毒效果，而且直接关系到经过脱毒后的材料能否应用。
    1.1 田间株选
    田间株选要注意以下几方面的问题：
    （1）所选的植株必须符合品种的特征，包括株型、叶形花色等生物学性状及成熟期等农艺性状。
    （2）植株生长健壮，无明显的病害症状，包括病毒病、真、细菌性病害。
    （3）适时早收。选相对单株产量及大薯率高的单株。
    1.2 块茎选择
    选符合品种特征的薯块，包括皮色、肉色、薯型、芽眼等、无病斑、虫蛀和机械创伤的大薯块作脱毒材料。
    1.3 马铃薯纺锤块茎类病毒检测
    马铃薯纺锤块茎病（Potato spinde Tuber Viroid 马铃薯纺锤块茎类)是由类病毒引起的，类病毒上一个没有蛋白质衣壳的小分子量核酸，它也是引起马铃薯“"的一重要病害，它的弱病系可造成20%-35%的减产，强系可减产60%。
    由于马铃薯纺锤块茎类病毒在目前用植物茎尖分生组织方法极难脱除，在进行脱毒前，首先要对入选的块茎进行马铃薯纺锤块茎类病毒检测。淘汰带有马铃薯纺锤块茎类病毒块茎，选用不带马铃薯纺锤块茎类病毒的块茎进行脱毒，否则脱毒后仍带马铃薯纺锤块茎类病毒。
    2 茎类脱毒
    2.1 催芽及温度处理
    （1）催芽，入选的块茎用15硫脲+5mg/L赤霉素浸种5分钟，以打破休眠。用温润沙覆盖，置于25℃黑暗条件下催芽。
    （2）材料消毒，待长到2CM时，用70%酒精过一遍，随即用5%-7%次氯酸钠溶液浸20分钟，然后用无菌水冲洗3-4次，剥取茎尖。
    （3）茎尖培养，第一次剖取1MM以上的大茎尖，进行离体培养。培养基MS+蔗糖3%、琼脂0.7%、PH5.8。待茎尖长至1CM时，转入光照培养箱，以每天16小时光照，（36±1）℃的高温处理6-8周。高问处理有利于钝化病毒，提高脱毒效果。
    2.2 茎尖分生组织培养
    经高温处理后的苗，在实体解剖镜下，剖取带有1-2个叶原基（约0.2-0.3毫米）的茎尖分生组织，进行离体培养。茎尖分生组织，处于分化的初级接，其初期维管还未与茎内的主维管相联通。此时植物体体内的病毒颗粒，只能通过细胞间连丝移动到分生区，而这一移动过程远不及细胞分裂的速度，利用这一特点，加之热处理钝化病毒活性，提高植株生长速度。剥取茎尖处0.1-0.5毫米分生区的细胞组织，进行离体培养，就可得到无病毒植株。从茎尖剥取的分生组织实际上只是刚开始分化的大细胞团，因而培养过程中应更加精心看护，注意培养基的成分和胚芽功能环境。
    茎尖分生组织培养基，MS+赤霉素0.mg/L+6-苄胺基嘌呤0.1mg/L+D-泛酸钙0.2mg/L+蔗糖2%,琼脂0.7%,PH5.8。培养条件（23±2）℃，16小时光照，光强2000m烛光。 ℃经
    经高温处理后，进行茎尖分生组织培养，可脱除马铃薯卷叶病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯S病毒、马铃薯杂斑病毒及马铃薯A病毒，但不能脱除马铃薯纺锤块茎类病毒。
    2.3 病毒检测
    由茎尖分生组织培养获得的试管苗，经第一次扩繁后，需对试管苗进行病毒检测，只有经病毒检测后，确认是不带病毒的株系，才能进一步利用。对带有病毒的株系，可以淘汰，或进行再次脱毒，试管苗病毒检测，采用酶联血清检测，配合指示植物及电镜观察完成。根据黄楚材等人（1980）的研究，马铃薯X病毒和S病毒离生长点很近，茎尖剥取长度须在0.2MM以下，Y病毒等离生长点较远，茎尖切取0.3-0.5MM就可以去掉，认为X病毒脱去与否是该植株有无病毒的重要标志，因此应特别注意对X病毒的检测。在全世界已报道了的30多种侵染马铃薯的病毒，类病毒和类菌体中，我国只有马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯M病毒、马铃薯卷叶病毒和马铃薯纺锤块茎类病毒分布广泛，危害比较严重（张鹤龄，1992）。因此我们对试管苗的病毒检测的重点应放在上述几种病毒上，特别是马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒。
    2.4 试种观察
    经病毒检测后确认不带有病毒的试管苗在进一步大量扩繁前，还需进行试种观察，即将每个无病毒株系的试管苗取出一部分移栽到大田试种、观察、检验其是否发生变异，是否符合原品种的全部生物学特性及农艺性状。茎尖分生组织是一个分裂很强的新生细胞组织，在培养过程中，极易因外界条件的改变发生变异，特别是当培养基内含有外源激素参与时，这种可能性就更大，这也就是育种学家常说的发生芽变，但在脱毒过程中，发生变异现象是不利的。另外在我们剥取茎尖分生组织时，由于细胞组织太小，因而也有可能取到的组织是不带有本品种全部遗传基因的嵌合体组织，由它进一步培养，产生的种薯就不会于原品种完全相符，这些株系都属淘汰之列。根据德国Bioplan公司的研究表明，这种变异发生率很低，在1987-1993年中经茎尖脱毒而发生变异仅有一个叶色变异的株系。
    对于要进行大量扩繁的无毒株系，在扩繁以前，都必须经过田间试种，检测其所有性状，淘汰变异株系，将符合原品种特征、特性的株系，进一步扩繁利用。
    3 脱毒试管苗快速微繁殖
    马铃薯是一种再生能力很强的植物，对培养条件的要求不太严格，但若要获得健壮的试管苗及高倍的繁殖速率，则需对马铃薯试管苗生长所需的营养成分、培养条件以及影响试管苗微繁殖速率的一些因素有个较全面的了解。
    3.1 培养条件
    快繁用培养基：MS+蔗糖3%，琼脂0.7%，PH5.8，在培养基内加入活性炭可提高茎的生长速度，有利于试管苗叶片伸展及壮苗，一般用量为0.3%。
    试管苗生长过程中，由于外界环境的影响，或因早期使用激素而产生的后效应，往往易形成茎杆细弱，叶片小、节间长的徒长苗，这种苗在试管微繁殖过程中，一般不影响繁殖速率，但对后期进行试管薯诱导或温室移栽则影响很大，特别是移栽不易成活。防止试管苗徒长，可以通过对外界培养环境的调整也可以用植物生长延缓剂，通过生理调节来解决，试验结果表明：多效唑、矮壮素、比久三种试剂加入在培养基内效果好，它能使茎加粗、节间变短，叶片大而厚，植株生长健壮。马铃薯试管苗生长与田间植株生长一样，有一定的昼夜温差有利于苗的健壮生长。对培养条件的要求为白天25-27℃，夜间16-20℃光照16小时，光强2000M烛光以上。
    3.2 继代次数及繁殖速率
    试管苗一般每间隔25天切转一次，扩繁率一般为3-6倍。从理论上推算，按一年继代12次，每次平均扩4倍，1株试管苗一年后可扩繁至16777216株，由此可见试管苗微繁殖的潜力很大，但是由于设备条件和技术上的原因，在实际操作时远达不到这种繁殖速率。在一间可控温的16平方米培养室内（可放置7个架子，每架6层，每层可放置100ml三角瓶128个，按每瓶装8株试管苗每年切转10次计）可年产试管苗43万株。
    长期继代培养的试管苗有可能再次染上病毒，据王军（1992）报道试管苗在寄代培养两年后，均发现有不同程度的病毒和细菌侵染，马铃薯X病毒80%，马铃薯Y病毒52%、马铃薯卷叶病毒46%、马铃薯M病毒20%，只有经过再次茎尖脱毒才能复壮更新。细菌的侵染主要是由于操作的不精心所致，而病毒的再现可能有三方面的原因，一是脱毒不彻底，脱毒后试管苗血清检测没有病毒反映，上因为植株体内病毒含量非常少，以致检测不到，试管苗多次继代后，病毒逐渐积累，从而再次出现病毒侵染；二是一些弱系病毒或一些暂时没有条件检测到的病毒，在强系病毒脱到后快速繁殖造成危害，三是由于操作及其他一些原因造成的病毒再次侵染。
    试管苗，在离体条件下多次继代，特别是长期生长在高激素含量的培养基中，还会引起芽变的可能。因此，马铃薯脱毒试管苗组培快繁，需两年更换一次基础苗，以提高试管苗的质量。为延长脱毒后的试管苗使用寿命，可采取扩繁初期分出一部分苗，转入保存用培养基，并给予有利的保存条件，每6-8个月切转一次苗，这样可以大大减少周转次数及污染机率，等快繁继代2年后，用保存苗替代，这样由两年更新脱毒一次，可延长到4-6年甚至8年才需脱毒复壮一次。长期处于抑制生长条件下的保存试管苗，是否会发生变异或其他生理上的不利影响，有待于进一步研究。保存苗在使用前仍需进行一次病毒检测及田间试种观察。保存苗培养基：MS+甘露醇4%，蔗糖3%，琼脂0.7%，PH5.8。
    3.3 培养器内微环境调控
    马铃薯是喜光和呼吸强度比较高的作物，培养器内湿度及二氧化碳浓度直接影响试管苗的生长，可以通过瓶口覆盖物进行调节。瓶口覆盖物透气性好的如棉塞、封口膜对试管苗生长有利，而透气性差的覆盖物，会使试管苗生长细弱，并内产生大量的气生根。当培养室温度高于27℃时，易产生茎尖枯死现象。
    培养瓶的大小，对试管苗的生长及繁殖率都有很大的影响，从试管内二氧化碳浓度测定及植株鲜重增长量的分析结果，可以看出培养瓶越大，越有利于试管苗的生长。综合试管苗生长势、繁殖率、污染率以及培养成本（培养基用量、消毒费、人工费等）分析，以用100-150ml培养瓶，繁殖马铃薯试管苗比较合适。
    3.4 真、细菌污染是植物组织培养过程中，普遍发生的问题，控制不好很容易形成毁灭性的灾难，特别是夏季阴雨天气空气湿度大，真菌孢子、细菌在空气中的含量很高，传播很快。必须作到提早预防及时控制。
    （1）要严格按操作规程作业，尽可能减少人为污染。试管苗切繁采用剪刀瓶内切段，瓶对瓶接种方式，减少污染机会。
    （2）工作人员应坚持每天巡视培养室发现污染瓶及时取出培养室。
    （3）降低培养室湿度，可采取安装空调或除湿机的方式，使空气相对湿度降低到60%以下，特别是在阴雨季节，更应注意除湿，以防污染大流行。
    （4）一旦发生污染大流行，要在清除全部污染源的同时，将培养室通风换气，并采用酒精喷雾、紫外灯杀菌。必要时可采用多菌灵等杀菌烟雾室内杀菌。
    （5）对十分珍贵的材料，或由于污染濒临灭绝的材料，可用青霉素或链霉素20万单位，救由于细菌污染的材料。用多菌灵5mg/L加入培养基内，救助由于真菌引起污染的材料。不同品种对这些杀菌剂的适应性不同，使用前最好做一下试验，以免珍贵材料丢失。材料在含有杀菌剂的培养基上培养一段时间后必须及时转回到正常快繁培养基，以免影响试管苗的生长。
    3.5 降低成本
    马铃薯试管苗组培快繁，试剂用量很大，成本相对较高，如何能降低成本，是大家所关心的问题。
    （1）培养基的简化 马铃薯试管苗快繁培养基，可以全部减去MS培养基养分组成中的各种有机物。只用其大量元素和微量，可以选用化学纯以下级别的试剂来代替。作为碳源的蔗糖和蒸馏水是组培快繁中用量较大的，试验证明，以市售的食用白糖替代化学纯蔗糖，以软化后的自来水（白开水）代替蒸馏水用于试管苗快繁，对试管苗生长无副作用。
    （2）该固体培养为液体培养 作为组培快繁培养基中重要角色的琼脂，是培养基所用各种试剂中成本比重最高的，约占26%以上。在试管苗组培快繁时，可以采用液体静止培养，代替现行的固体培养，去掉琼脂，能大大降低培养基成本，同时由于操作简单可提高切转效率。一般选用250ml三角瓶，每瓶装液体培养基20ml，接种茎段15-20个，试管苗靠叶片浮在培养基表面。操作时应注意尽可能避免对培养瓶的震动，以防新接茎段完全淹没在培养基内，因窒息而死。液体培养植株生长快，繁殖率高，但容易发生细菌污染蔓延，应及时防止。
    4 试管薯诱导
    马铃薯试管薯诱导，应注意下面几方面的问题。
    4.1 培育壮苗
    培养出健壮的试管苗，做诱导材料，是试管薯诱导成败的关键，只有在诱导结薯前一个阶段中培养出根系发达茎杆粗壮，叶色浓绿的试管苗，才能获得高产、优质的试管薯。
    （1）优良株系的选择 同一品种的试管苗，不同株系之间在相同的培养条件下，其生长势及植株在试管中表现不一样，有的株系长势就细弱，而有的株系植株就表现的非常强壮，不同株系在相同的诱导条件下试管薯的结薯率及薯重有很大的差异。这可能是由于不同株系内生理代谢略有差异造成的。因此在试管薯诱导之前有必要对诱导材料加以筛选。
    （2）壮苗用培养基 作为诱导前培育壮苗的培养基一般为更换培养基的方面，多采用液体静止浅层培养，常用的培养基有MS+食用白糖3%+活性碳0.15%，PH5.8和MS+食用白糖3%+比久3mg/L,PH5.6，视苗生长情况而选择使用。将带有2-3个茎节的试管苗，丢掉顶芽（以利同步生长）接种在液体培养基上，静止培养，3-4周后每个茎段发育成一株具有5-7个节的健壮苗，换成诱导结薯培养基，3-4天后试管内开始有试管薯形成。
    （3）培养条件控制 壮苗培养温度以白天23-37℃，夜16-20℃为宜，昼夜有一定的温差有利于试管苗的生长。马铃薯是喜光作物，光周期和光强对马铃薯试管苗的生长有很大影响，16小时的长光照及增加光强到4000M烛光以上，有利于试管苗的健壮生长，培养瓶要选用透气性好的封口物，以利气体交换，促进壮苗的形成。
    4.2 试管薯诱导
    （1）诱导培养基 常用的诱导马铃薯试管薯的基本培养基为MS培养基，胡运海等的研究证明，降低培养基中的总氮水平和硝态氮的比率有利于提高微型薯的成薯率。因此也有选B5培养基为基本培养基的，因为B5培养基中总的氮素水平特别是硝态氮的水平较低。
    关于诱导结薯的培养基中是否加入植物激素。王军（1992）认为，只要诱导结薯的环境条件适宜，植物体内能够合成足够的内源激素或结薯刺激物，那么任何外源生长调节物质都可以取消。根据作者的试验结果来看，王军的观点是对的，但是，没有外源诱导激素参与、结薯慢且单株结薯率及薯重都低于有外源激素参与的处理。为了能在短期内大量生产高质量的试管薯，6-苄胺基嘌呤和矮壮素作为诱导剂是必要的，至少在没有完全了解试管薯发育机理并寻找出更有效的诱导方法之前是这样。试管薯诱导培养基MS+6-苄胺基嘌呤5mg/L+矮壮素500mg/L，食用白糖8%，PH5.8。更换诱导培养基时，最好将培养凭内原有的壮苗培养基去掉以利结薯。
    （2）诱导试管薯的环境条件 Simmon(1989)、李灿辉（1990）等试验表明，在诱导结薯阶段每天予以8小时的光照处理，可以显著提高试管薯的产量和质量。我们的试验中在8小时光照下形成薯块的时间明显晚于暗培养，而总结薯块数没有明显优势。现在采取的培养方式为：当加入诱导培养基后继续在16小时光照条件下培养3天转入暗培养，能提高试管薯结薯率。培养温度20℃，若用密封式人工培养箱暗培养，每天要开一次培养箱的门更换培养箱内空气，以利块茎的发育。
    4.3 生长周期
    试管薯诱导周期为50-60天，即试管苗茎段接种到壮苗形成位5-30天，诱导培养开始到收获25-30天。采用50ml三角瓶每瓶15个芽段，一次可收试管薯20-30粒，多者可达50粒以上。
    试管薯收获后要用清水多次冲洗。用滤纸吸去表面的水，置于4℃冰箱保存，待其自然通过休眠后，取出播种。由于试管薯水分含量大，体积相对较小，储存过程中应注意保水分。
    5 扦插生产微型薯
    扦插生产微型薯是在人工隔离条件下保护地进行的。
    5.1 基础苗栽培
    将试管苗切成带有一个芽的茎段，转入生根培养基一周后小苗长成带右4-5片叶及3-4条小根的健壮苗，移栽前去掉试管封口，锻炼两天，即可移栽，在温、湿度条件合适时移栽成活率可达90%以上。生根培养基1/2MS+吲哚乙酸0.2mg/L+食用白糖2%+琼脂0.7%，PH5.8。
    移栽苗基质：蛭石：草炭：消毒田园土=1：1：1，每立方米基质加入2KG磷酸二铵做基肥。移栽初期应覆盖塑料薄膜及遮荫网纱以保持湿度及防止强光直射。散射光利于缓苗，1周后幼苗长出新根，可逐渐去掉薄膜及遮荫网纱。待苗长至5-8片叶时即可进行第一次剪切，以后每20天可剪切一次。基础苗一般栽植密度为每平方米800株。
    基础苗管理：每次切剪后，需喷施10ml/L赤霉素及营养液一次，平时每隔一天浇一次水。营养液：可以用MS基本培养基中的无机盐代替。
    5.2 扦插生产微型薯
    有基础苗上剪切苗的顶部，一般带有2-3片叶，在生根剂中浸2分钟，扦插于基质中。扦插的基质及插后苗初期管理与基础苗移栽时相同，扦插密度为每平方400株。生根剂：吲哚丁酸200mg/L+赤霉素5mg/L。
    扦插苗长至10片叶以上时，苗基部要覆一次基质土，以利结薯，后期若有徒长现象，可喷施100ml/L矮壮素，以抑制生长，促进块茎膨大。
    扦插后45-60天可收获，每株结薯1-3个，单个重0.5g以上，最大块茎重20g。每次每平方米可收获500-600块。

 

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