罗汉果的组织培养

罗汉果为我国特有的药用植物，属葫芦科苦瓜属。是我国特有的保健药材，由于它的果实、种子、叶有清热凉血、润肺止咳及润肠通便之功效，在治疗肺病、慢性气管炎、咽喉炎、便秘等多方面都有很好的疗效，深受人们的喜爱。
    罗汉果营养价值丰富，干果含糖30%左右，蛋白质10%左右，每100克果实中含有维生素C 100毫克。其果仁含油量高达40%，而且其中主要是油酸和亚油酸，约占70%左右。
    利用植物组织培养法进行天然甜味剂的生产和开发，具有十分广阔的前景。罗汉果苷是罗汉果中最主要的有效成分，由于罗汉果苷结构中的糖苷键都是β键，在人体内不能被分解消化掉，故具有特殊的保健功能。罗汉果苷属葫芦素烷型化合物，苷原的结构和葫芦素相似，但味甜而不苦，是一类苷的总称。作为甜味剂添加于各类食品中，其中的罗汉果苷V的甜度为蔗糖的250-350倍，VI的甜度为蔗糖的125倍，因此对糖尿病、高血压、慢性支气管炎等的患者是一种极为理想的保健品。罗汉果还可与绿茶、桂花、绿豆等配制成各具特色的保健饮料。市场上销售的罗汉果，不但有球形罗汉果，也有罗汉果的浓缩液、果冻和糖果等。
    随着生活水平的提高，人们的保健意识逐渐加强，罗汉果的需求量也不断增大。罗汉果利用传统繁殖速度很慢，不能满足市场需求。为了扩大罗汉果的繁殖，可采用组织培养的方法来快速繁殖罗汉果。
    （一）取材和处理
    将罗汉果的种子先用含0.02%餐洗净的自来水浸泡10分钟，浸泡时要不断搅动，然后用自来水冲洗干净。将洗净的种子拿到超净工作台上进行消毒接种。把种子放到一干净三角瓶中，加入70%的酒精消毒30秒，这时也要不停的摇动，将酒精倒掉之后，再加入0.1%升汞溶液消毒5分钟，这时同样也要不断搅动，然后用无菌水冲洗5次，也可以用10%的次氯酸钠溶液消毒15分钟，再用无菌水冲洗3-5次。
    消毒完毕之后，将种子从三角瓶中取出，放在消毒滤纸上将水分吸干，放置于不含激素的MS培养基上培养三周左右，可获得长有5-6片真叶的罗汉果无菌苗，取其叶片作愈伤组织诱导的实验材料。
    （二）叶片培养诱导再生植株
    1、配制诱导分化再生培养基
    本实验中使用的诱导再生培养基为MS基本培养基，即MS的大量元素、微量元素、有机物和铁盐4种基本成分，再附加6BA0.7-1.5mg/L、IBA 0.3-0.7mg/L,用1mol/L的KOH调节PH至5.8，加琼脂粉5克，高压灭菌后分装入90MM的培养皿中，每皿约25毫升，在超净工作台上吹干后加盖封口，以防污染。
    实验结构显示，在MS基本培养基中添加KT、ZT、IAA、NAA、2，4-D等激素，虽然也可以诱导出愈伤组织，但基本上不能分化产生芽，所以建议不要再用这些激素做重复性实验，以防浪费人力、物力和时间。
    2、接种与培养
    由于使用的是试管苗，所以实验材料无需再进行表面消毒处理。从试管苗上摘取整片生长健壮、完全展开的幼叶，将叶片放在无菌滤纸上，用解剖刀在叶片背面（远轴面）横划三刀，但不要完全切断叶片，就是说不要切断叶子的上表皮。将叶片平放于培养皿中的培养基上，使背面与培养基接触。摆放密度要适中，以每片叶子间隔 1CM左右为宜，过密则营养不足，过稀则不仅浪费培养基而且再生频率会降低，一般说来每皿可放置20-25片。
    叶片在培养室内培养大约一周左右，体积明显膨大呈凹凸不平状，这预示细胞在进行生长和活跃的分裂。再过3周左右，可以看到从外植体有切口的地方，分化出许多圆形小突起，这些突起便是分生性细胞团或芽原基。再经过一段时间，众多的小突起就分化出一些丛生的芽。由于整个分化的周期比较长，所以中间最好更换一次培养基。
    由于芽丛生在一起，又是在培养皿中，所以很难继续生长。因此需要把丛生芽从培养皿中转移到三角瓶中，使其长高长壮。
    3、生根
    配制生根培养基，成分是1/2MS基本培养基，附加NAA0.3-0.5mg/L,琼脂粉5.5-6.0g/L,调PH5.8，煮沸后分装于100ml或 150ml三角瓶，用羊皮纸封口，经高压灭菌后备用。从壮苗培养基上选取高的壮苗，再在无菌滤纸上用解剖刀从基部切去3-5MM，将小苗转到生根培养基上，每瓶7-8株为宜。将三角瓶置于常规培养室中培养，大约10d左右就可看到小苗长出比较发达的根系。
    用羊皮纸封口还是用塑料纸封口，对三角瓶内培养的材料的生长影响很大。用塑料纸封口可以保持三角瓶内有较高的空气湿度，有利于芽和苗的高度生长；虽然也可以长根，但根的质量不好，常常是在近培养基的上方嫩茎的周围生出许多纤细的毛状根。用羊皮纸封口通气性较好，有利于壮苗，也有利与生长出健壮的根。因此，选用哪种封口材料，应根据培养的目的来决定。
    4、移载
    待根长至1CM左右时，将捆扎三角瓶口的绳子或皮筋解开，但不要把盖子拿掉。将三角瓶转到低于培养室温度的地方，最好有散射的太阳光，约一周时间即可以移栽。移栽用的介质是中性土壤，且最好经过消毒处理。移栽的小苗注意湿度的调节，其周围的空气湿度比移栽基质的湿度更重要。一旦移栽，其周围湿度降低，就会使叶片皱褶，容易死苗，湿度过高则容易烂根。生长试管苗的温室应在20-25度，这样与培养室的温度相当，有利于成活。光线不可太强，开始几天最好遮阴，为了保证试管苗的正常生长，温室内应经常喷洒杀虫剂、杀菌剂。
    5、利用愈伤组织生产罗汉果苷
    培养的愈伤组织细胞仍然含有罗汉果苷，因此可以不进行再生芽的诱导而直接用愈伤组织进行罗汉果苷的工厂化生产。关于罗汉果苷的提取工艺已经基本成熟，只要能获得大量愈伤组织，就可以实现大规模工厂化生产。

 

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