病毒诱变因素及其诱变机理

录入时间:2009-6-17 9:05:58 来源：青岛海博

诱变因素及其诱变机理

从整个遗传学的角度而言，人们对变异的认识是从自发突变开始的。自发突变的原因目前尚不清楚，可能是外界因素和内部因素共同作用的结果。1927年Muller用X射线处理果蝇精子，证明可诱发突变，显著提高突变率，从此开始了人工诱变研究的历史。在病毒方面，人工诱变最先成功于烟草花叶病毒，随后对痘病毒、新城疫病毒、伪狂犬病病毒、脊髓灰质炎病毒等动物病毒进行人工诱变试验，亦获成功。如果配合应用选择条件和病毒纯化措施，使原种的增殖受到抑制，一般都能较快获得突变株。能够引起或促进病毒变异的各种理化学因子，严格地讲还应包括生物学因子，通称为诱变因素或诱变剂。紫外线、X线和γ射线等物理因素可扰乱或破坏病毒核酸的正常结构而使病毒灭活或导致突变(详见本书第五章)。生物学因子主要指病毒感染之后，在宿主体内产生的各种免疫学因子，如免疫球蛋白、干扰素和各种细胞因子等。其中免疫球蛋白，即特异性抗体，可能有着特殊意义。使病毒在免疫动物或免疫人体中连续传代，或者应用次中和量的免疫血清与病毒混合，在鸡胚或培养细胞内多次传代，一般都能较快获得抗原变异株。如上述，流感病毒和口蹄疫病毒等的抗原自然变异，可能也是病毒在部分免疫的人群或畜群中周转的结果。而新的变异株的形成，又将引起新的流行，进而改变人群或畜群的免疫状态，反过来又促进新的变异的产生，有关内容请参阅本书各论部分。这里主要论述在人工诱变中最常用的化学诱变剂。化学诱变剂大致可以分为两大类，下面分别加以叙述。 [BT4]1.在病毒增殖过程中呈现作用的诱变剂主要指各种嘧啶和嘌呤的类似物，前者包括5溴尿嘧啶(5BU)、5氟尿嘧啶(5FU)、5溴脱氧尿核苷(5BUDR)和5氟脱氧尿核苷(5FUDR)，后者如2氨基嘌呤(2AP)。这类诱变剂在病毒核酸合成过程中替代某些正常碱基而进入核酸结构，部分病毒因而灭活，另一部分病毒则因此而发生突变。丫啶类化合物，如原黄素以及丫啶橙等，则是由于能够插入邻近两个嘌呤之间，在核酸复制时造成碱基增加或缺失的错误导致变异。现以5溴尿嘧啶和2氨基嘌呤为例，说明嘧啶和嘌呤类似物的诱变机理。胸腺嘧啶的甲基被一个溴原子代替，就是5溴尿嘧啶，两者在结构上十分相似。正常情况下胸腺嘧啶的6位上是一个酮基，所以能和相对位置上的腺嘌呤的氨基形成氢键。胸腺嘧啶也可以另一互变异构形式(烯醇式)出现，但在生理条件下，酮式占绝对优势。5溴尿嘧啶5位上的溴原子改变了酮式和烯醇式之间的平衡关系，使较常出现烯醇式，烯醇式的5溴尿嘧啶不能与腺嘌呤形成氢键，却能与鸟嘌呤形成氢键。5溴尿嘧啶代替胸腺嘧啶(T)与腺嘌呤(A)配对，其结果，正常的A-T配对变为A-BU(图6-7左)。当5溴尿嘧啶由酮式状态转变为烯醇式状态时，则与鸟嘌呤(G)配对而成G-BU(图6-7右)。最终使原来的A-T转换成G-C(A-T→G-C)。同样地，如果DNA分子的某一位置有一对碱基G-C，在复制时5溴尿嘧啶代替了C而掺入，经过两次复制就在该位上出现一对A-T

(如图6-8)。[HT5”SS][JZ]图6-7 左：5BU酮式.和A配对；右：5BU烯醇式.和G配对

[HT5SS][HT5”SS][JZ]图6-8 左：A-T→G-C；右：G-C→A-T[HT5SS]　　2氨基嘌呤是腺嘌呤结构的类似物，能与胸腺嘧啶配对，但也可以呈现亚氨基形式而与胞嘧啶配对，因此也可诱发A-T→G-C转换。 [BT4]2.对病毒核酸直接呈现作用的诱变剂根据化学性质和具体呈现的作用，又将这些物质分为几个类别，分述如下： (1) 非烷化剂类：包括甲醛(HCHO)、羟胺(H2NOH，HA)、甲羟胺(H2NOCH3

)，MHA)、亚硝酸、重硫酸盐(HSO3)和肼(H2NNH2，HZ)，如图6-9所示。[HT5”SS][JZ]图6-9 非烷化类诱变剂的结构[HT5SS]　　甲醛可与核酸中的氨基发生可逆反应。这种反应呈很强的构象依赖性，即主要作用于单链核酸。甲醛与核酸的A、G、C反应形成羟甲基衍生物(图6-10)；另一方面，用甲醛处理RNA后可产生CH2交联体，这是甲醛引起的第二种较缓慢的反应(图6-11)。

[HT5”SS][JZ]图6-10 非烷化剂与核酸和核苷酸的反应产物[HT5SS][HT5”SS][JZ]图6-11 诱变剂引起的交联反应[HT5SS]羟胺和甲羟胺可与A、C和U反应，其中与U反应导致产生糖基脲而使之灭活(最适pH10)，与C

或A反应(最适pH5～6)导致氨基被羟氨基(NHOH)或甲羟氨基(NHOCH3)取代(图6

-10)。亚硝酸是传统的氧化脱氨基试剂(NH2→OH)，曾被认为是完美的诱变剂。经脱氨基作用后腺嘌呤(A)变为次黄嘌呤(HX)，鸟嘌呤(G)变为黄嘌呤(X)，胞嘧啶(C)变为尿嘧啶(U)。当A→HX时，由于HX在核酸复制过程中优先与C配对，所以使A-T变成G-C，发生了A→G和T→C转换(图6-12A)。当C变成U时，因U优先与A配对，所以使G-C变成AT，发生了G→A和C→T转换(图6-12B)。当G变成X时，由于X优先与C配对，虽然不出现G-C→A-T转换，但XC本身是不正常的碱基对(图6-12C)。同时，亚硝酸也可引起交联，并曾观察到交联的G-G和G-A(图6-11)。[HT5”SS][JZ]图6-12 亚硝酸的氧化脱氨作用及其影响[HT5SS]　　重硫酸盐可使C脱氨变为U而引起突变(图6-13)。[HT5”SS][JZ]图6-13 重硝酸盐的脱氨作用[HT5SS]　　肼为一种弱诱变剂，主要作用于胞嘧啶(pH6)，在N4上发生取代反应产生N4氨基胞嘧啶(图6-10)。 (2) 烷化剂类：主要指烷基硫酸酯类及其N亚硝基化合物类，前者包括二烷基硫酸酯(如硫酸二甲酯，DMS；硫酸二乙酯，DES)和烷基磺酸链烷(如甲基磺酸甲酯，MeMS；甲基磺酸乙酯，EtMS；乙基磺酸乙酯，EtES)。后者包括二烷基亚硝胺(如二甲基亚硝胺，DMNA；二乙基亚硝胺，DENA)，N亚硝基脲(如甲基亚硝基脲，MeNU；乙基亚硝基脲，EtNU)和N烷基N硝基N亚硝胍(如甲基硝基亚硝基胍，MNNG)(图6-14)，它们的诱变作用各不相同，作用活性顺序为甲基〉乙基〉更高同聚物。多聚核苷酸上的所有氧(O)和氮(N)(除了直接与糖相接的N外)均可在pH中性水溶液中被烷基化，其中烷基硫酸酯几乎完全与N反应，而N亚硝基化合物主要作用于O。各种碱基烷化后的衍生物如图6-15所示。[HT5”SS][JZ]图6-14 简单烷化剂的结构[HT5SS][HT5”SS][JZ]图6-15 简单烷化剂在水溶中与核酸或多核苷酸反应的位点

[HT5SS]　　此外还有环状烷化剂，包括氮芥、硫芥、β丙酸内酯和脂肪环氧化物等(图6-16)。其中最早研究的是氮芥、硫芥，它们可与G的N7、A的N1、C的N3反应，氮芥也可使两个G的N7间发生交联。β丙酸内酯可与G的N7和A的N1反应，也可形成分子内交联，推测A的N3也可被修饰。脂肪族环氧化物，如乙烯氧化物、丙烯氧化物，为弱的诱变剂，环氧化物类似于典型的烷化剂，与DNA和RNA上G的N7，A的N1和N3反应，形成羟乙基或羟丙基衍生物。[HT5”SS][JZ]图6-16 环状烷化剂类的结构[HT5SS]　　最后一种重要的烷化剂为盐亚硝基脲(halonitrosoureas)，包括1,3双［2氯乙基］1亚硝基脲(BCNU)，双［2氟乙基］亚硝基脲(BFNU)和1［2氯乙基］3

环己基1亚硝基脲(CCNU)(图6-17)，它们可在G的N7上形成盐乙基、羟乙基和氨乙基衍生物，或在A的N1和C的N3上发生盐乙基反应形成环乙基衍生物，此外，也在DNA中观察到O6羟乙基鸟嘌呤和3羟乙基胞嘧啶。[HT5”SS][JZ]图6-17 盐亚硝基脲类的结构[HT5SS]　　经烷化的碱基除了可导致随后的配对错误外，还可能因为从核苷酸序列中脱掉而留下一个缺口，影响DNA的复制，或使核苷酸序列缩短，引起移码突变；同一DNA分子链内或不同DNA分子的链间形成交联，也能使一个或几个核苷酸缺失。

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