两种不同种源地白榆的组织培养与叶片再生研究

摘要：采用河北沧州市和内蒙赤峰市两种不同种源地的白榆茎段作为外殖体进行组织培养，在附加不同浓度激素的培养基上对其进行增殖、叶片再生及生根培养，建立其组织培养及叶片再生体系。结果表明，来自河北沧州市的白榆最适分化培养基是Ms 培养基＋6-BA 0.10mg/L＋IBA0.005mg/L，最适生根培养基是MS 培养基＋IBA0.01mg/L，而来自内蒙赤峰市的白榆最适分化培养基是Ms + 6-BA 0.10mg/L＋IBA0.025mg/L，最适生根培养基是Ms 培养基＋IBA0.05mg/L。两种白榆叶片再生的最适培养基均为MS + TDZO.O05mg/L + IAA0.005mg/L 。
关键词：白榆；组织培养；种源地；叶片再生
白榆为榆科榆属，又称：榆、家榆。白榆是河北省常见的速生阔叶用材树种，同时也是城市绿化、防护林、盐碱地改造的主要树种。作为城市园林绿化的重要树种，白榆的最大特点是用途广泛，既可作为乔木，也可作为灌木、剪型树、绿篱；从种植方式既可作为孤植树，也可以作为行道树、林带（丛植或密植）等，同时白榆适应性强、管理粗放、病虫害较少，是中国北方少有的多用途乡土树种。十九世纪初，正值西方列强到中国收集植物种质资源之时，还大量的引种了中国北方白榆，该品种对白榆荷兰病（Dutch Elm Disease , DED ）有极强的抗性，在美国西部沙碱化地改造起了重要作用。近年来，国内对白榆的种质资源的研究与保存、杂交育种及实生苗选育、种源变异、分子遗传学和非常规育种等方面进行了研究和总结。由于白榆抗虫性较差，而目在逆境条件下群体内分化程度大，从而在一定程度上影响了发展和利用。国家在“六五”到“八五”期问选育出的一批速生白榆优质无性系，在一些地区表现出较好的适生性，个别无性系表现出一定的抗虫能力，但是在更广阔地区发展白榆仍受到上述主要问题的严重困扰。
随着对白榆研究的发展和深入，尤其是育种工作对遗传基础探索的迫切要求和分了生物学研究成果对传统遗传育种的影响和巨大冲击，国内外许多研究己经逐渐转向白榆的遗传学基础研究，并逐渐将细胞和组织培养、分了标记技术等引入白榆改良研究中。建立一个再生体系是进行遗传转化的先决条件。由于白榆对2.4-D 非常敏感，在进一步应用中受到了一定的限制。Kapaun等人从白榆的叶组织中得到了再生植株，但是再生芽率很低，产生的芽伸长困难，产生的小苗生根困难等一系列问题尚未解决。该研究以白榆种子为材料进行组织培养，讨论附加不同浓度激素的培养基对其增殖、生根的影响，为白榆的生物技术改良和优良品系的快速繁殖提供了理论依据。
1 材料与方法
1.1 试验时间、地点
室内试验于2008 年在河北农业大学林学院组培实验室进行。
1.2 材料
此试验所用的外殖体为白榆当年生茎段，2008 年4 月分别采自河北沧州市和内蒙赤峰市。
1.3 方法
1.3.1 无菌苗的获得取白榆茎段，用自来水冲洗30 min , 在无菌操作台上，70 ％酒精浸泡30s , 20 % 8-4消毒液浸泡14 min ，无菌水冲洗4 - 5 次，接种于不附加任何激素的MS 培养基上进行培养。
1.3.2 培养条件 该试验所采用的基本培养基是MS 培养基和1 / 2MS 培养基，附加不同的浓度及不同种类的激素。培养基加蔗糖20g/L，琼脂6.5g/L，pH5.8 - 6.0 。培养条件为温度25 ℃ ，光照度2000~3000lx ，光照时间10h 。
1.3.3 分化培养基的筛选取无菌苗带芽茎段（l.5~2.0cm ) 接于附加不同激素的MS 培养基上进行培养，30 天后调查白榆在附加不同浓度激素的MS 培养基上的分化情况，统计增殖率、平均苗高、平均叶片数、平均愈伤块直径、是否玻璃化。
增殖率＝（增殖后外殖体数／接种外殖体数）x100%

1.3.4 叶片分化培养基的筛选取无菌苗叶片，叶片横切2 ~3 刀，剪过中脉，均平铺于附加不同激素的MS 培养基上，进行培养。在培养基上培养45 天后，统计出愈率、不定芽再生率及死亡率。
出愈率=（形成愈伤组织的外殖体数/接种外殖体数）x 100 %
不定芽形成率=（产生不定芽的愈伤组织块数/接种外殖体数）x100%
死亡率＝（死亡外殖体个数／接种外殖体数）x100%

1.3.5 生根培养基的筛选取无菌苗茎段（l.5 ~2.0 cm ) 接于附加不同激素的MS 和1 / 2 MS 培养基上进行试验，30 天后调查白榆在附加不同浓度激素的培养基上的生根情况，统计生根率及平均苗高。生根率＝（有生根现象的茎段数／接种茎段数）x 100 %
生根系数＝生根条数／有生根现象的茎段数

2 结果与分析
2.1 白榆无菌苗的获得
采用20 % 8-4消毒液消毒14 min ，接种于不附加任何激素的MS 培养基中即可获得白榆无菌苗，且长势良好，适宜获得白榆的无菌苗。
2.2 不同激素类型与浓度对白榆带芽茎段分化的影响在MS 培养基中添加不同浓度的6-BA、NAA 、IBA 对两种白榆的带芽茎段进行培养，培养30 天后进行调查，结果见表1 ，两种白榆的增殖情况见图1 和图2 。在不添加任何激素的MS 培养基上两种白榆都可生长，但平均茎高和增殖率较低。在附加6-BA和NAA 的MS 培养基上两种榆树的分化状况都很差。当6-BA浓度大于0.25mg/L , NAA 浓度大于0.O25mg/L时两种榆树都发生了玻璃化现象，增殖产生的新芽虽多，但茎叶纤细发黄，或呈水渍状，非常不利于继续生长，且激素浓度越高玻璃化现象越严重。当6-BA浓度降至0.lomg/L，NAA 浓度降为0.005 、0.010 、o.o25mg 飞时玻璃化现象得到控制，但是平均茎高和增殖率都下降了很多。在附加6-BA和IBA 的MS 培养基上，当6-BA浓度为0.25 mg 飞时两种白榆都发生玻璃化现象，降低6-BA浓度后玻璃化现象得到控制，平均茎高和增殖率都有所提高。其中在附加6-BA 0.10mg/L和赤峰白榆最适分化培养基是Ms + 6-BA 0.10mg/L十IBA0.005mg/L的MS 培养基上河北沧州白榆分化最好，平均茎高为2.65 cm ，增殖率达到了243 ％。而内蒙赤峰白榆最适分化培养基是MS+6-BA0.10mg/L+IBA0.025mg/L, 其平均茎高为2.50 cm ，增殖率为263 ％。
2.3 不同激素时白榆叶片不定芽诱导的影响
在MS 培养基中添加不同浓度的TDZ 、ZT 、IAA 对两种白榆的叶片进行培养，培养45 天后进行调查，结果见表2 ，叶片诱导情况见图3 和图4 。两种白榆的叶片都具有一定的再生能力且两者之间再生能力差异很小，但再生率都很低。在附加ZT 和IAA 的MS 培养基上两种白榆出愈率很低，基本上不产生不定芽。在附加TDZ0.005mg/L和IAAO.005mg/L的Ms 培养基上两种白榆的表现最好，出愈率均为96% ，河北沧州白榆的不定芽再生率为56 % ，内蒙赤峰白榆的不定芽再生率达到52 ％。将叶片上产生的不定芽分别接种到各自适宜的增殖培养基上，不定芽生长正常，可得到白榆的健壮小苗。
2.4 不同生根培养基对白榆生根的影响
在MS 和1 / 2MS 培养基中添加不同浓度的NAA 和IBA ，对两种白榆的带芽茎段进行培养，接种数天后逐渐从基部和茎节处产生数条不定根，培养30 天后调查其生根状况，结果见表3 ，生根情况见图5 和图6 。在不添加任何激素的MS 培养基上两种白榆均可生根，但生根率很低，河北沧州白榆为36 % ，内蒙赤峰白榆仅为15 ％。在附加不同浓度NAA 的MS 培养基上，两种白榆均可生根，河北沧州白榆的生根率较高，可达到87 % ，但生根系数很低，新生芽细弱；内蒙赤峰白榆生根率很低，最高的才达到54 ％。附加相同浓度IBA 的MS 培养基比1 / 2 MS 培养基更适合白榆生根。其中河北沧州白榆在五种附加不同浓度IBA 的1 / 2MS 培养基上的平均茎高、平均根长、生根率和生根系数均不及MS 培养基：内蒙赤峰白榆在五种附加不同浓度IBA 的1 / 2 MS 培养基上除平均根长的一个数值外其他各项生根指标均不及MS 培养基。因此最适宜河北沧州白榆生根的是附加IBAO.01mg/L 的Ms 培养基，其生根率达100 % ，生根系数8.94 ；内蒙赤峰白榆在附加IBAO.05mg/L的Ms 培养基上生长健壮，生根率最高达89 % ，生根系数4.80 。
3 小结与讨论
( 1 ）两种白榆各自适合的增殖培养基中添加的激素种类相同均为6-BA和IBA 的组合，但浓度略有差异。来自河北沧州市的白榆最适分化培养基是MS 培养基＋6 –BA0.10mg/L + IBA0.005mg/L ，来自内蒙赤峰市的白榆最适分化培养基是Ms 十6-BA 0.10mg/L＋IBAO.025mg/L 。
( 2 ）河北沧州市的白榆最适生根培养基是MS 培养基＋I BA0.01 mg/L，内蒙赤峰市的白榆最适生根培养基是Ms 培养基十IBAO.05mg/L 。各种培养基中内蒙赤峰白榆多不如河北沧州白榆易于生根，内蒙赤峰白榆最高生根率89 ％不及河北沧州白榆的100 ％。

( 3 ）两种白榆无论是生根培养还是增殖培养中，凡是添加NAA 的培养基表现都不好，增殖培养中极易玻璃化，生根培养中生根率较低。是否白榆对NAA 敏感有待进一步研究。
( 4 ）生根培养中两种白榆在MS 培养基上的表现都比1/2Ms 培养基上的表现好，不同于其他多数植物适宜在1 / 2MS 培养基中生根的特点，这可能与白榆极高的抗盐碱能力有关。
( 5 ）两种白榆都具有叶片再生能力且两者之间再生能力差异很小，但再生率较低有待进一步研究。

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