新型可复制型疫苗
(1) 基因缺失型弱毒疫苗：通过非天然宿主传 代选择得 到的突变株，其基因组可能发生了多个突变，因此对其致弱的遗传基础无法确定。 随着分 子病 毒学研究的不断深入，人们发现某些病毒 的 毒力或毒力相关基因与病毒复制无关，造成该基因的缺失突变后，其毒力丧失或明显减弱， 但病毒复制能力并不丧失， 同时保持着良好的免疫原性。因此通过基因工程技术造成病毒 基因组中 负责毒力的基因缺失而制成的疫苗称为基因缺失型弱毒疫苗。造成病毒基因缺失的 方法， 是首先在体外利用限制性内切酶对含有毒力基因的部分病毒DNA基因组进行酶切, 然 后再通过同源重组的方法构建成缺失型病毒株。对于由正链RNA组成的病毒基因组, 必需 先转录成cDNA，然后才能进行酶切和同源重组操作。由负链RNA组成的病毒基因组 目前尚不能进行类 似操作，因为人们还不能成功地将病毒cDNA转化为具有感染性的负链RNA病毒。 缺失可以是一个基因的全部，或是一个基因的部分；也可 以是两个基因或其部分缺失, 通过两个缺失基因的协同作用使病毒致弱; 还可以是非编码区 基因的缺失。 采 用缺失的方法可 能会制造出免疫原性好，且在安全性上更有保证的弱毒疫苗株，也可以改造现行的免疫原性 还不能令人满意的弱毒株以增强其安全性。将多瘤 病毒基因的部分早期区造成缺失后，用该突变株感染乳鼠，复制水平是野生型病毒的 1%～１０%，而在体外细胞培养物上，突变株和野生型病毒之间滴度无明显差异, 但是缺 失突变株不象野生型病毒那样，前者不引起乳鼠的持续性感染。说明在病毒基因组的 适当区域内造成缺失后， 病毒在体内的复制受到限制，但对其在细胞培养物上的生长无任 何影响, 同时降低了其致病性。 单纯疱疹病毒(HSV)是构建缺失型疫苗的首选病毒之一。目前对HSV基因组的结构及其功能 已经比较清楚 ，可以通过选择性地灭活特异性基因达到致弱目的。如将HSV1和HSV2的22基因缺失后， 对小鼠的神经毒性明显降低。近年来人们进一步把该病毒的胸腺激酶 基 因(TK)缺失掉，这样不仅降低了毒力，而且在接种小鼠后，能够保护小鼠抵抗野生型病毒的 攻 击。牛疱疹病毒1型(BHV1)TK基因缺失疫苗于1984年首先在美国报道，采用鼻内、肌肉 及静脉内试用接种均无致病性，其唯一的缺点是疫苗病毒具有潜伏性。1994年澳大利 亚学者Smith构建了一株BHV1的TK基因缺失株，肌肉和静脉注射后，能诱导机体产生良好 的免疫反应，且无明显的副作用。伪狂犬病病毒TK疫苗已于1986年获美国农业部动植 物 检疫总署批准投放市场， 并在此基础上，研制出缺失主要膜糖蛋白gpⅢ区的第二代缺失型 疫苗株。目 前已经得到广泛应用。美国提出了要在2000年消灭伪狂犬病的目标。国内也在开展 类似缺失型疫苗的研制工作， 鸡传染性喉气管炎病毒的缺失株亦在构建中。此 外，由于许多从RNA病毒获得的cDNA具有感染性，人们预测RNA病毒缺失株的研究也将逐步开 展。由于缺失型疫苗是人为地将病毒的毒力基因切除，往往不可能完全自行修复，因而不 会发生返祖 现象，在遗传特性上比较稳定，是今后弱毒疫苗的研究方向之一。
(2)插入突变株: 在 病毒基 因组内插入一定数量的碱基或核酸片段，可能造成毒力基因的活性丧失。 但插入的核酸片 段可 能出现丢失现象，使病毒的毒力回复。 有报道在病毒基因组中插入白介素2等 基 因。如在痘苗病毒基因组中插入白介素2基因降低了其对实验小鼠的致病性。插入的蛋白 可能起类似于IFN的作用，导致重组病毒的复制能力降低。IFN基因插入后 可能也会对病毒毒力具有一定致弱作用。
(3)病毒载体活疫苗: 在某些病毒的基因组内有一些核苷酸序列(如痘病毒的TK基因，腺病毒 的E1和E3区等), 将其 切除或突变或在该区域内插入外源性基因片段后, 均不影响病毒的复制, 是病毒的复制非必 需区。利用基因工程的方法，可以将该复制非必需区克隆出来，经过体外改 造后，将异源性病毒的保护性抗原基因及启动子调控序列等插入其中，再通过体内同 源重组技术， 获得重组病毒, 利用该重组病毒接种动物后，不仅可以诱导机体产生针对异源性病毒的 特异性免疫反应，而且在采用宿主特异性载体病毒时，能够使宿主获得针对与载体病毒 相应的强 毒株的免疫力，如果在载体病毒中同时 插入多个异源性病毒的保护性抗原基因就可以达到 一针防 多病的目的。这样的基因工程重组疫苗称为病毒载体活疫苗。 目前用于表达外源性病毒蛋 白的载体病毒包括痘病毒(痘苗病毒和宿主 特异性痘病毒)、腺病毒、疱疹病毒和小RNA病毒等。痘苗病毒具有宿主范围广、增殖滴度 高、 稳定性 好、 基因组容量大、含多个非必需区等特点，因此，有利于进行基因工程操作和适于插 入多个外源 基因。同时，痘苗病毒经过在人体内长期使用后证明其抗原性稳定, 免疫原性持久，能够同 时 诱发体液和细胞免疫, 相对安全。 因此是研究最早和最成功的载体病毒之一。 但是痘苗病 毒 在种痘后局部反应较大，在人接种后有百万分之一发生全身性发痘和种痘后脑炎等并发症倾 向。近年来针对痘苗病毒的某些不足之处，相继开展了鸡痘病毒、金丝雀痘病毒、猪痘病毒 、羊痘病毒以及兔痘病毒载体的研究，并取得了良好的进展。尤其是禽类痘病毒, 由于用该 病 毒接种哺乳动物后, 可以引起顿挫型感染, 但却可以持续表达外源基因, 并且 不影响再次接种, 日渐引起人们的关注。
在进行痘病毒载体构建时， 主要应考虑以下因素:
①启动子。 痘病毒与其它大多数DNA病毒不同，是在胞浆内复制，病 毒DN A转录时，必需靠其自身合成的RNA聚合酶，因此在痘病毒内表达外源基因时，必须使用痘病 毒自身的启动子，在痘苗病毒和禽痘病毒载体构建时，外源基因前多使用来自于痘苗病毒的 早期启动子P7.5，或晚期启动子PL11；
②外源病毒结构蛋白基因。 由于痘病毒不具有编接 机 制, 外源病毒结构蛋白基因应为其连续编码区，不能有内含子或间隔区；
③终止子。 为了 不影响痘病毒载体基因的正常表达，在使用早期启动子时，在3’末端加上早期基因转录终 止子T5N T；采用晚期启动子时不必考虑终止子问题，晚期启动子的转录可在痘病毒基因组中被终止 。痘病毒不识别其它真核基因的转录终止子；
④非必需区同源序列。 由于将外源性病毒基 因导入痘病毒的机理是同源重组, 因此，在构建载体时，必需在外源目的基因及启动子两侧 带有痘病毒基因组的同源序列，同源序列一般取自于病毒复制非必需区，这样可以保证 病毒的复制能力不受影响。迄今在痘苗病毒或其它痘病毒载体中表达的动物病毒保护性抗 原有狂犬病病毒糖蛋白和核蛋白、禽流感病毒血凝素、传染性法氏囊病病毒VP2、鸡新城疫 病毒 血凝素蛋白和融合蛋白(F)、马立克氏病毒糖蛋白B(gB)、脾坏死型禽网状内皮组织增生症病 毒、 鸡传染 性支气管炎病毒纤突蛋白、牛水泡性口炎病毒糖蛋白以及猪伪狂犬病病毒糖蛋白等。腺病 毒可以通过呼 吸道或消化道感染，激发宿主局部免疫反应。 其基因组DNA相对较小， 含有2个复制非必 需区, 便于操作。如以人腺病毒5型狂犬病病毒糖蛋白重组载体免疫小鼠和犬，可以诱导 较高水平的抗体，并可保护小鼠抵抗致死性攻击。 异源性无致病性的火鸡疱疹病毒载体亦已构 建成功。在HVT载体中表达的外源性目的基因有新城疫病毒F基因， 马立克氏病毒gB基因等。此外，利用弱毒株猪伪狂犬病病毒、鸡传染性喉气管炎病毒构建 活载体疫苗的研究，也取得了明显进展。以RNA病毒为 活载体的研究近年来也有一些令人鼓舞的报道。如小RNA病毒科中的脊髓灰质炎病毒(PV)Sab in疫 苗株在实际应用中证明安全、稳定、可口服，并且易增殖，感染滴度高。研究发现，PV中的 结构蛋白P1区在基因组复制时是非必需的，缺失P1区的亚基因组虽可复制，但不能包装成病 毒 粒子，在提供P1壳粒之后，亚基因组可以被包装起来，形成病毒粒子。因此可以将P1区中的 部 分氨基酸缺失掉，代之于外源性病毒保护性抗原决定簇，形成嵌合病毒粒子，以PV为载体 研 究的嵌合病毒包括PVⅠⅡ型、PVⅠⅢ型间嵌合体病毒、 PV人免疫缺陷病毒(跨膜 糖蛋白 gp41中和抗原表位)、PV人乳头瘤病毒16(L1蛋白16氨基酸肽段抗原表位)嵌合体病毒。在 兽疫病毒中以口蹄疫病 毒的保护性抗原决定簇核酸片段构建的PVFMDV嵌合体病毒, 能使豚鼠抵御侵染。 脊髓灰 质炎病毒作为载体与前面所述的病毒活载体有所不同，前述载体系将外源性保护性抗原分泌 到 载体病毒粒子以外，而脊髓灰质炎病毒载体表达的外源性病毒蛋白则以嵌合的形式存在于载 体病毒 颗粒的表面。二者均可以构建成多价载体疫苗。但是小RNA病毒基因组容量较小，插 入的外源基 因片段大小有限; 插入不当会造成致死性突变; 形成的嵌合体病毒增殖较慢; 外源性病毒抗 原的免 疫原性较弱等。因此小RNA病毒作为载体的研究尚有待于进一步深入改进和完善。以负链RNA病毒， 如流感病毒， 作为载体的研究亦已尝试多年，并取得重大进展。流感病 毒 RNA没有感染性，不能自行复制。为了使重组的RNA能够复制并具有感染性，Luytjes等建立 了流感病毒核糖核蛋白体(RNP)的重组及转染系统，即用提纯的病毒RNA聚合酶和核蛋白与 体外重组的病毒RNA组建具有转染活性的RNP，然后将RNP转染进已被辅助病毒感染的细胞。E nami等构建的重组流感病毒RNA表达质粒中，流感病毒的非结构蛋白基因被外源基因的反 义序列取代，当质粒转录后，重组病毒RNA与核蛋白和RNA聚合酶重建成为RNP，在流感病毒 依赖RNA的RNA聚合酶作用下，外源基因的反义序列即被转录成为正义链，并随病毒的复制 而表达。严家新等将人免疫缺陷病毒(HIV) MN株gp120抗原上V3环中的12肽核酸序列，插入 流感病毒A/WSN/33株血凝素B抗原位点的突出环状结构上，构建成嵌合体病毒。表达V3环中1 2肽的嵌合体病毒能够诱导小鼠产生HIV特异性抗体。由于流感病毒可以同时诱导体液免疫 和细胞免疫，并能产生IgA介导的粘膜免疫，因此，有希望成为新型的高效活疫苗。(4)遗传重配疫苗： 适用于分节段基因组的病毒，如正粘病毒和轮状病毒等。其原理是 将具有特殊保护性抗原的强毒野毒株与弱毒株共感染鸡胚或培养细胞，通过两毒株间的自然 生理重配, 获得 重配减毒活疫苗。目前流感病毒的冷适应重配疫苗和鸭人毒株重配疫苗在人的临床试验 中，已经取得有希望的结果。在动物, 用人流感病毒热敏株和马流感病毒野毒株进行遗传重 配, 也获得了减毒的重配马流感病毒疫苗, 由于该重配疫苗能够表达马流感病毒的血凝素 和 神经氨酸酶, 因而接种后能够使幼驹获得免疫保护。禽流感以及蓝舌病病毒的遗传重配疫苗 研究也取得了一定进展。 另外，利用不同属小RNA病毒(口蹄疫病毒和肠道病毒)也实现了体内重配 ，并得到了重配 病毒株。
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